La señalización MAVS es necesaria para prevenir la infección cardíaca persistente por chikungunya y la inflamación crónica del tejido vascular.

Nov 17, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4668 (2023) Citar este artículo

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La infección por el virus Chikungunya (CHIKV) se ha asociado con manifestaciones cardíacas graves; sin embargo, aún se desconoce cómo la infección por CHIKV conduce a la enfermedad cardíaca. Aquí, aprovechamos tanto modelos de ratón como células cardíacas primarias humanas para definir los mecanismos de la infección cardíaca por CHIKV. Utilizando un modelo de ratón inmunocompetente de infección por CHIKV, así como células cardíacas primarias humanas, demostramos que CHIKV infecta directamente y se replica activamente en los fibroblastos cardíacos. En ratones inmunocompetentes, el CHIKV se elimina del tejido cardíaco sin daños significativos mediante la inducción de una respuesta local de interferón tipo I de células cardíacas infectadas y no infectadas. Utilizando ratones deficientes en los principales componentes de señalización de la inmunidad innata, descubrimos que la señalización a través de la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS) es necesaria para la eliminación viral del corazón. En ausencia de señalización MAVS, la infección persistente conduce a miocarditis focal y vasculitis de los grandes vasos adheridos a la base del corazón. Se observó vasculitis de grandes vasos hasta 60 días después de la infección, lo que sugiere que el CHIKV puede provocar inflamación vascular y posibles complicaciones cardiovasculares duraderas. Este estudio proporciona un modelo de infección cardíaca por CHIKV y una visión mecanística de la enfermedad cardíaca inducida por CHIKV, lo que subraya la importancia de monitorear la función cardíaca en pacientes con infecciones por CHIKV.

Los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus), como el virus Zika, el virus del dengue y el virus chikungunya (CHIKV), están asociados con el desarrollo de miocardiopatías en pacientes1,2,3,4,5,6. Se han informado manifestaciones cardíacas asociadas al CHIKV en más de 15 países en todo el mundo5,7. Las complicaciones cardíacas ocurren dentro de la primera semana después del inicio de los síntomas5 e incluyen síntomas que van desde arritmias, fibrilación auricular, ecocardiogramas y electrocardiogramas anormales8, reducción de la fracción de eyección6, miocarditis8,9,10, hasta insuficiencia cardíaca y muerte9,11,12,13. . Las autopsias de individuos que sucumbieron a la infección por CHIKV revelan la presencia del antígeno CHIKV en el tejido cardíaco12,14 y una infiltración de células inmunes indicativa de miocarditis viral, así como signos de edema cardíaco, endocarditis, necrosis y congestión cardíaca9. De hecho, más del 20% de los casos de mortalidad relacionados con CHIKV se han asociado con complicaciones cardíacas9,12,15. Aunque la mayoría de las complicaciones cardíacas se han observado en adultos mayores y en personas con comorbilidades11,16, se han informado manifestaciones cardíacas asociadas con infecciones por CHIKV en personas jóvenes, incluidos niños y bebés sin comorbilidades conocidas6,8,9.

Si bien estudios previos informaron un vínculo entre CHIKV y la infección del tejido cardíaco en modelos animales17,18,19,20,21, varias preguntas siguen sin respuesta: (i) ¿es el tejido cardíaco un objetivo directo de la infección por CHIKV y un sitio de replicación activa en pacientes inmunocompetentes? ¿Hospedadores?; (ii) ¿cuáles son los mecanismos de interacción CHIKV-tejido cardíaco?; (iii) ¿cómo responde el corazón a la infección por CHIKV?; y (iv) ¿cómo la infección por CHIKV provoca enfermedades cardíacas?

Aquí, utilizando un modelo de ratón inmunocompetente de infección por CHIKV, así como células cardíacas primarias humanas, demostramos que CHIKV infecta directamente y se replica activamente dentro del tejido cardíaco, siendo los fibroblastos cardíacos el principal objetivo celular de la infección por CHIKV. Mostramos que CHIKV infecta el miocardio, las válvulas, las aurículas y los vasos, y que el ARN viral persiste por más tiempo en el tejido que contiene las aurículas y los vasos en comparación con el miocardio. Mostramos que la infección cardíaca por CHIKV se elimina rápidamente sin signos de inflamación del tejido o daño del tejido cardíaco en ratones inmunocompetentes coincidiendo con una respuesta local de interferón tipo I (IFN-I). De hecho, la infección del tejido cardíaco induce una respuesta local de IFN-I en células cardíacas infectadas y no infectadas, y la pérdida de señalización de IFN-I da como resultado un aumento de las partículas infecciosas de CHIKV, la propagación del virus y la apoptosis en el tejido cardíaco. Demostramos que la respuesta de IFN-I es esencial para controlar la infección por CHIKV en fibroblastos cardíacos primarios humanos. Además, descubrimos que la señalización a través de la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS), un centro central para la transducción de señales iniciada por los receptores de reconocimiento de patrones citosólicos (PRR) RIG-I o MDA5, es necesaria para la eliminación eficiente del CHIKV, siendo las partículas virales detectado hasta 10 días después de la infección (dpi) en ratones Mavs-/-. Es importante destacar que encontramos que la persistencia de la infección por CHIKV en el tejido cardíaco de ratones Mavs-/- conduce a un daño del tejido cardíaco caracterizado por infiltrados de CD3+ y CD11b+ en el miocardio y la aurícula, así como en los grandes vasos adheridos a la base del corazón. como la aorta (Ao) y la arteria pulmonar (PA). Curiosamente, se detectó miocarditis viral a los 10 y 15 ppp, mientras que la vasculitis de grandes vasos que afectaba a la Ao y la PA persistió hasta los 60 ppp, lo que sugiere que la infección del tejido cardíaco por CHIKV puede provocar inflamación vascular y posibles complicaciones cardiovasculares duraderas.

En general, nuestros resultados muestran que se requiere una respuesta sólida de IFN-I y señalización MAVS para controlar la infección por CHIKV en el corazón y prevenir la miocarditis focal, así como la vasculitis Ao y PA. En conjunto, este estudio proporciona información mecanística sobre cómo CHIKV puede provocar daño cardíaco, subrayando la importancia de monitorear la función cardíaca en pacientes con infecciones por CHIKV y allanando el camino hacia la identificación de factores de riesgo asociados con el desarrollo de complicaciones cardíacas inducidas por CHIKV.

Si bien se ha detectado la presencia de productos virales de CHIKV en tejido cardíaco de animales infectados17,18,19,20,21, sigue siendo difícil determinar si CHIKV está infectando y replicando dentro de las células cardíacas. El tejido cardíaco está muy irrigado; por lo tanto, es esencial verificar que el virus detectado en homogeneizados de corazón se origine en células cardíacas infectadas y no en virus circulantes. Para abordar esto, probamos el efecto de la perfusión en ratones altamente susceptibles con deficiencia del receptor de interferón α/β (Ifnar1-/-), un modelo de ratón en el que se detectaron partículas infecciosas de CHIKV en corazones no perfundidos20. De hecho, si bien el tejido perfundido mostró niveles detectables de ARN de CHIKV, estos disminuyeron significativamente en comparación con los ratones no perfundidos (Figura complementaria 1a). Por lo tanto, incorporamos un paso de perfusión a todos nuestros experimentos. Para definir si el tejido cardíaco es un objetivo directo de la infección por CHIKV en ratones inmunocompetentes, infectamos a los ratones por vía subcutánea mediante inyección en la almohadilla plantar, por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola o mediante transmisión natural por picadura de mosquito. Cuantificamos el virus infeccioso CHIKV mediante la dosis infecciosa media de cultivo de tejidos (TCID50) en células BHK-21 y el ARN de CHIKV mediante RT-qPCR. Pudimos detectar genomas de CHIKV y partículas infecciosas de corazones perfundidos en ratones infectados independientemente de la ruta de inoculación (Fig. 1a y Fig. 1b complementaria), lo que respalda el tejido cardíaco como un objetivo genuino de la infección por CHIKV. Para evaluar si las partículas virales de CHIKV detectadas en el corazón se estaban replicando activamente, medimos la relación entre las transcripciones de CHIKV nsp4 y E1 mediante RT-qPCR como sustituto del ARN genómico y subgenómico, respectivamente, a 2, 5 y 10 ppp. Como control no replicativo, infectamos ratones con CHIKV inactivado por calor (HI). Si bien no se detectó replicación activa para el control HI, se detectó replicación activa de CHIKV en el corazón tanto para la ruta de inoculación subcutánea como para la intravenosa (Fig. 1b). Para los ratones infectados por vía intravenosa, la replicación activa se detectó a 2 ppp (R [Relación E1/nsp4] = 3,81, p = 0,047) y 5 ppp (R = 8,11, p = 0,008), mientras que para los ratones infectados por vía subcutánea, la replicación activa se detectó a 5 ppp (R = 3,88, p = 0,008). La diferencia en la cinética entre las vías de inoculación es consistente con el requisito de que la inoculación subcutánea alcance la viremia para diseminar e infectar el tejido cardíaco, mientras que la vía intravenosa evita esta etapa de la infección. Estos resultados demuestran que el tejido cardíaco es un objetivo directo de la infección por CHIKV en ratones inmunocompetentes.

a Se inocularon ratones C57BL/6 de seis semanas de edad con 1E5 PFU de CHIKV o se les infectó de forma simulada como se especifica en cada panel. Subcutáneo: infectados por CHIKV (n = 11) y simulados (n = 5). Intravenoso: infectados por CHIKV (n = 11) y simulados (n = 8). Picadura de mosquito infectados por CHIKV (n = 11) y simulados (n = 9). b Relación de ARN viral E1 a ARN viral nsp4. La línea de puntos indica la proporción de ARN E1:ARN nsp4 (R) de 1. Subcutánea: 2 ppp (n = 4), 5 ppp (n = 8) y 10 ppp (n = 4). Intravenosa: 2 dpi (n = 6), 5 dpi (n = 6) y 10 dpi (n = 4). Control HI: 2 ppp (n = 3), 5 ppp (n = 6) y 10 ppp (n = 4). c Imágenes representativas de 2 experimentos independientes que muestran miocardio infectado (escala = 20 μm) y válvula aórtica, aurícula izquierda y vasos (escala = 30 μm). Flechas blancas: células infectadas por CHIKV. d Los ratones se infectaron con 1E5 PFU de virus CHIKV o HI por vía intravenosa. Panel izquierdo: niveles de ARN de CHIKV para los corazones superior e inferior. Panel derecho: proporción de niveles de ARN viral entre las secciones superior e inferior del corazón. Para 2 ppp n = 5, para 5 ppp n = 5, para 10 ppp n = 3. El cuadro gris representa los niveles de ARN de fondo cuantificados para el control HI a 5 ppp (n = 1). e Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de 3 experimentos independientes de secciones ventriculares de corazones infectados por CHIKV teñidas con diferentes marcadores de tipos de células cardíacas. Escala = 15 µm. f Análisis de colocalización entre células infectadas por CHIKV y diferentes marcadores de tipo celular. Los datos se representan como el porcentaje de la señal verde total (células infectadas) que se superpone con los marcadores indicados. El análisis de colocalización se realizó en 3-4 campos independientes para n = 3 ratones. g Curvas de crecimiento de ciclos múltiples de CHIKV en células cardíacas primarias humanas. n = 2 experimentos independientes en duplicados técnicos. Los datos se representan como media ± error estándar de la media (SEM, a, b, d, f, g). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitney de dos colas (a, b) o la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis y Dunn (d, f). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar la localización de la infección por CHIKV dentro del tejido cardíaco, utilizamos un CHIKV indicador que expresa la proteína fluorescente ZsGreen (CHIKV-ZsGreen) exclusivamente bajo replicación viral activa17. Los ratones se infectaron con CHIKV-ZsGreen y se recogió tejido cardíaco a 2 ppp. Observamos múltiples focos positivos para ZsGreen correspondientes a células infectadas con CHIKV en ratones infectados tanto por vía intravenosa (Fig. 1c) como por vía subcutánea (Fig. 1c complementaria). CHIKV infecta diferentes estructuras del tejido cardíaco, con presencia de células infectadas dentro del miocardio, válvulas aórticas, aurículas y vasos (Fig. 1c). Con el objetivo de medir las diferencias en el nivel de infección en el tejido cardíaco, separamos físicamente el corazón en: (i) sección superior (que contiene aurículas y está enriquecida con vasos adheridos a la base del corazón, como la aorta torácica ascendente) y (ii) sección inferior (enriquecida en miocardio); y evaluó la cinética de la infección por CHIKV. Para abordar la infección directa del tejido cardíaco y evitar la variabilidad asociada con las diferencias en la diseminación, utilizamos la ruta de infección intravenosa a menos que se indique lo contrario. Descubrimos que, si bien CHIKV puede replicarse eficientemente en las secciones superior e inferior del corazón a 2 ppp (R = 1,47; Fig. 1d, panel izquierdo), los genomas de ARN de CHIKV persisten durante tiempos más prolongados en la sección superior que contiene los vasos y las aurículas (5 ppp: R = 5,07 y 10 ppp: R = 6,35, Fig. 1d, panel derecho). De hecho, encontramos que la sección superior del corazón contiene mayores cantidades de genomas virales en relación con la sección inferior (Fig. 1d). Estos resultados respaldan que las diferentes estructuras del tejido cardíaco no son igualmente susceptibles a la infección por CHIKV y que la sección que contiene vasos grandes sostiene una mayor carga viral de CHIKV.

Para identificar los tipos de células específicas infectadas por CHIKV en el tejido cardíaco, se recolectaron corazones a 2 ppp, se fijaron y se procesaron para obtener criosecciones en serie seguidas de tinción con marcadores para tipos de células cardíacas específicas: CD31 (células endoteliales), CD45 (leucocitos), αSMA (células de músculo liso, pericitos y miofibroblastos), cTnT (miocitos cardíacos) y vimentina. Es de destacar que la vimentina se expresa en niveles elevados en los fibroblastos cardíacos22, pero también puede expresarse en células del músculo liso, células endoteliales y macrófagos23,24,25. Por lo tanto, identificamos células de fibroblastos cardíacos como poblaciones de vimentina + / αSMA - / CD31 - / CD45 -, una combinación que validamos ortogonalmente mediante la expresión de ARN unicelular de Tabula Muris26 (Figura complementaria 1d). Mediante el uso de microscopía de fluorescencia y análisis de colocalización con los diferentes marcadores de tipo celular, encontramos que el 78,5% de la señal CHIKV-ZsGreen se colocalizó con células vimentina+/αSMA- (Fig. 1e, f y Fig. complementaria 1e, f). Este resultado, junto con la reducida colocalización entre la señal CHIKV-ZsGreen y los marcadores de células endoteliales (CD31+; 7,63%), leucocitos (CD45+; 7,16%), músculo liso/pericitos/miofibroblastos (αSMA+; 0,38%) y miocitos cardíacos ( cTnT+; 4,39 %; Fig. 1f; Fig. complementaria 1f) demuestran que los fibroblastos cardíacos son el objetivo principal de la infección por CHIKV del tejido cardíaco in vivo.

Finalmente, intentamos determinar si las células cardíacas humanas muestran susceptibilidades a la infección por CHIKV similares a las observadas en ratones. Para ello, evaluamos la capacidad de CHIKV para infectar células cardíacas primarias humanas in vitro. Infectamos fibroblastos cardíacos primarios humanos (hCF), miocitos cardíacos humanos (hCM) y células endoteliales de la microvasculatura cardíaca humana (hCE) con una MOI de 0,1 y medimos la producción de partículas infecciosas. Descubrimos que CHIKV puede infectar eficientemente hCF (Fig. 1g, círculos negros), pero no hCE (Fig. 1g, cuadrados), lo que respalda nuestras observaciones in vivo en ratones. Curiosamente, la hCM en cultivo produjo partículas infecciosas de CHIKV en niveles similares a los observados para las hCF (Fig. 1g, círculos abiertos). Sin embargo, se debe interpretar cuidadosamente este resultado, ya que las hCM en cultivo pierden características específicas que potencialmente pueden afectar la susceptibilidad a la infección por CHIKV. Por ejemplo, mientras que los miocitos cardíacos en el tejido se caracterizan por ser multinucleados y quiescentes in vivo, el cultivo in vitro revierte estos fenotipos, dando como resultado células mononucleadas y proliferantes27.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que CHIKV se replica activamente en el tejido cardíaco, siendo los fibroblastos cardíacos el principal objetivo celular de la infección por CHIKV en ratones inmunocompetentes.

Para evaluar las consecuencias de la replicación del CHIKV en el tejido cardíaco, medimos la cinética de la infección por CHIKV en el corazón, así como el daño cardíaco, la apoptosis y la inflamación. Se detectaron niveles significativos de ARN de CHIKV en el corazón de ratones infectados por vía intravenosa tan pronto como 12 h después de la infección (hpi) con un pico a los 2 ppp, y la infección desapareció a niveles de detección de fondo a los 9 ppp (Fig. 2a, izquierda). panel). Las partículas infecciosas siguen una tendencia similar, con un pico de producción de partículas infecciosas entre 1 y 2 ppp, y niveles no detectables a los 9 ppp (Fig. 2a, panel derecho). Curiosamente, aunque con niveles más altos de ARN de CHIKV, la cinética de replicación viral sigue un patrón temporal similar cuando se mide en el músculo de la pantorrilla, un órgano primario de replicación de CHIKV (Figura complementaria 2a). Por lo tanto, estos resultados demuestran que la infección por CHIKV se elimina eficazmente del tejido cardíaco en ratones inmunocompetentes.

a Panel superior: Representación esquemática del diseño experimental. Panel inferior: genomas virales de CHIKV o partículas infecciosas de CHIKV de homogeneizados de tejido cardíaco determinados mediante RT-qPCR o TCID50, respectivamente. Genomas virales de CHIKV: control HI (n = 39), 6 hpi (n = 5), 12 hpi (n = 5), 1 ppp (n = 9), 2 ppp (n = 18), 3 ppp (n = 7), 5 ppp (n = 13), 9 ppp (n = 8) y 21 ppp (n = 8). Partículas infecciosas, control HI (n = 18), 6 hpi (n = 5), 12 hpi (n = 5), 1 ppp (n = 9), 2 ppp (n = 8), 3 ppp (n = 7 ), 5 ppp (n = 4) y 9 ppp (n = 4). b Niveles séricos de troponina T cardíaca medidos mediante ELISA: infectados simulados (n = 23), 2 ppp (n = 33) y 5 ppp (n = 14). c Cuantificaciones de núcleos CASP3 escindidos versus núcleos totales de secciones ventriculares completas teñidas (ver "Métodos"). norte = 3/grupo. d Gráfico que muestra los niveles relativos de proteínas de citocinas y quimiocinas proinflamatorias entre homogeneizados de corazón infectados con CHIKV y con infección simulada a 2 y 5 ppp. La expresión relativa se representa en log2 veces el cambio (tamaño de diamante). La significación estadística se expresa como una escala de colores (valor p ajustado -Log10). 2 ppp: corazones control HI e infectados por CHIKV (n = 6/grupo). 5 ppp: control HI (n = 4) y corazones infectados por CHIKV (n = 5). e Gráficos de volcán a partir del análisis de expresión diferencial a 2 ppp (panel izquierdo) y 5 ppp (panel derecho). El rojo y el azul indican genes regulados positivamente (FDR <0,15 y log2 (FC)> 1) y regulados negativamente (FDR <0,15 y log2 (FC) <-1), respectivamente. Se indican los 10 principales genes expresados ​​diferencialmente. n = 4 ratones/grupo. f Análisis de enriquecimiento de vías GSEA para conjuntos de datos de Hallmark que muestran las vías principales con regulación positiva y negativa a 2 ppp y 5 ppp. n = 4 ratones/grupo. Los diagramas de caja muestran la mediana y los rangos de cuartiles, los bigotes representan el rango (a, b). Los datos se representan como media ± SEM (c). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis y Dunn (a), y ANOVA unidireccional con la comparación múltiple de Dunnett (b, c). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se han observado niveles elevados de troponinas cardíacas en individuos con manifestaciones cardíacas asociadas al CHIKV6,7,13,16. Para definir si CHIKV puede provocar daño cardíaco en ratones, evaluamos los niveles séricos de troponina T cardíaca (cTnT) a 2 y 5 ppp mediante ELISA. No observamos diferencias significativas en los niveles de troponina T cardíaca en suero entre los controles infectados y PBS o HI (Fig. 2b), lo que sugiere que la replicación de CHIKV no induce daño a los miocitos cardíacos. De hecho, no se observó ningún signo de apoptosis del tejido cardíaco a 3 o 5 ppp (Fig. 2c, control de tinción positivo en la Fig. 2b complementaria). Por lo tanto, no se observa daño cardíaco en ratones WT tras la infección y eliminación de CHIKV.

Aunque no se observó daño cardíaco en CHIKV en ratones WT, encontramos que la infección por CHIKV estimula la producción de proteínas de citocinas y quimiocinas proinflamatorias en el tejido cardíaco (CCL2, CCL5, CCL3, TNFα, IL6, IFNγ, IL2, KC, IL1α, IL12p70, e IL12p40) a 2 ppp. Sin embargo, IL12p40 es la única citocina que permanece regulada positivamente a 5 ppp (Fig. 2d; Fig. complementaria 2c, d), lo que indica que la infección por CHIKV está induciendo un estado inflamatorio transitorio en el tejido cardíaco. El análisis histopatológico de la tinción con hematoxilina-eosina (H&E) de secciones de vista de cuatro cámaras de infectados y simulados a 3, 5, 10 y 15 ppp (Datos complementarios 1) no reveló infiltrados visibles de células mononucleares en los ventrículos, el tabique o las aurículas. de corazones infectados por CHIKV. En conjunto, estos resultados demuestran que el tejido cardíaco puede eliminar eficazmente la infección por CHIKV sin daño cardíaco significativo en ratones inmunocompetentes.

Para comprender cómo el corazón elimina rápidamente la infección por CHIKV sin dañar el tejido cardíaco en ratones WT, medimos la respuesta transcripcional de homogeneizados de corazón infectados por CHIKV mediante ARN-seq en masa. Utilizamos ratones infectados con CHIKV a 2 ppp (donde detectamos tanto el ARN de CHIKV como las partículas infecciosas de CHIKV) o a 5 ppp (donde detectamos pocas o ninguna partícula infecciosa de CHIKV, pero se detectan niveles de ARN de CHIKV; Fig. 2a). Para identificar cambios derivados únicamente de la replicación activa de CHIKV, utilizamos el virus HI como control. El análisis de componentes principales (PCA) mostró que las réplicas biológicas se agruparon por tratamiento (Figura complementaria 3a). Se detectaron un total de 377 genes regulados positivamente y 84 genes regulados negativamente a 2 ppp, y 259 genes regulados positivamente, así como 52 genes regulados negativamente a 5 ppp (Fig. 2e, Fig. Suplementaria 3b, c; Datos complementarios 2 y 3). Los 10 principales genes regulados positivamente en ambos días incluyen genes asociados con la protección del daño del tejido cardíaco y el metabolismo de las mitocondrias (Apod, Atf5, Mthfd2)28,29, respuesta de IFN-I (Ifi27, ​​Ddx60, Serping1), señalización de citoquinas (H2-K1 ) y cascada del complemento (C4a, C4b, C1ra) (Fig. 2e). De acuerdo con estas observaciones, el análisis de enriquecimiento de la vía GSEA para los conjuntos de datos de Reactome y Hallmark muestra una regulación positiva (FDR <0,15 y puntuación de enriquecimiento normalizado [NES] > 0) de varias vías asociadas con la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa y la señalización de IFN (Fig. 2f, Suplementario). Fig. 3c, datos complementarios 2 y 3, y tablas complementarias 2 y 3). Las vías reguladas a la baja (FDR <0,15 y NES <0) en homogeneizados de corazón infectado a 5 ppp incluyen vías metabólicas como el metabolismo de aminoácidos, el transporte respiratorio de electrones y la fosforilación oxidativa, entre otras (Figura complementaria 3c).

La inducción de vías de señalización de IFN-I en células no hematopoyéticas es esencial para controlar la infección por CHIKV en mamíferos30,31. Descubrimos que la vía del IFN-I se induce significativamente en corazones infectados por CHIKV tanto a 2 como a 5 ppp (Fig. 3a y Fig. 3e complementaria). En particular, observamos una regulación positiva de los genes estimulados por interferón (ISG; por ejemplo, Isg15, Ifitm3, Mx1, Mx2, Ifit1, Ifit2, Ifit3, Ifi27, ​​Ddx58 y Ddx60, entre otros), así como de genes implicados en la vía de señalización de IFN-I ( por ejemplo, Irf7, Stat1, Stat2; Datos suplementarios 2 y 3). Si bien los niveles séricos de IFNα e IFNβ estaban elevados a las 24 hpi, no se observaron cambios en los niveles locales de IFNα e IFNβ en corazones infectados a las 12 o 24 hpi (Figura complementaria 3f). Esto sugiere que el IFN-I circulante contribuye a la respuesta local de IFN-I provocada por el tejido cardíaco tras la infección por CHIKV.

a Mapa de calor que muestra los genes expresados ​​diferencialmente (FDR <0,15) de la vía de respuesta Hallmark IFNα para corazones infectados con CHIKV y con control HI. b Panel superior: imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de dos repeticiones independientes que muestran secciones ventriculares de corazones infectados con CHIKV y control de PBS teñidos con anticuerpos anti-ISG15 y anti-vimentina. Escala = 10 µm. Panel inferior: Cuantificación de señal/campo ISG15+. El análisis se realizó en dos campos independientes para el control de PBS (n = 2) y los infectados por CHIKV (n = 6). c Dependencia de la señalización de IFN-I en fibroblastos cardíacos primarios humanos durante la infección por CHIKV. Las células se trataron previamente como se indica en la figura y se infectaron con CHIKV-ZsGreen a una MOI de 0,25. Los datos representan tres repeticiones independientes en duplicados técnicos. d Experimentos de pretratamiento con IFN-I en tipos de células cardíacas primarias humanas. Las células se trataron previamente con diferentes concentraciones de IFN-α recombinante (panel derecho) e IFN-β (panel izquierdo) durante 24 h y luego se infectaron con CHIKV-ZsGreen a una MOI de 0,25 durante 24 h. Para IFN-α: tres repeticiones independientes en duplicados técnicos. Para IFN-β: cuatro repeticiones independientes en duplicados técnicos. e Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de tres repeticiones independientes que muestran corazones infectados con CHIKV-ZsGreen WT o Ifnar1-/- a 1 ppp. Escala = 30 µm. f Porcentaje del total de células infectadas (señal verde) que se superponen con los fabricantes indicados (consulte la figura complementaria 1d, e). El análisis de colocalización se realizó en tres a cinco secciones independientes para n = 2 ratones. g Panel izquierdo: la tinción de apoptosis se midió mediante IHC frente a CASP3 escindido. Escala = 50 µm. Las flechas resaltan los focos apoptóticos. Panel derecho: las cuantificaciones de los núcleos CASP3 escindidos versus los núcleos totales se realizaron en secciones ventriculares completas (VI, VD y tabique) utilizando VisiopharmR. Cada punto representa un ratón individual. Control de PBS (n = 5), ratones WT infectados con CHIKV (n = 5) y ratones Ifnar1-/- infectados con CHIKV (n = 6). Los datos se representan como media ± SEM (b – d, f, g). Los valores de p se calcularon utilizando Mann-Whitney de dos colas (b), o ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett (c, d, g), o Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn (f). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comprender mejor si la respuesta de IFN-I observada por RNA-seq estaba mediada localmente por fibroblastos cardíacos infectados, medimos la producción local de proteínas de ISG15 e IFITM3, ambos ISG que se sabe que restringen la infección por CHIKV32,33, y descubrimos que ambos estaban regulados positivamente. a 2 ppp en corazones infectados por CHIKV (Fig. 3a y Fig. complementaria 3d). Si bien IFITM3 se expresa en niveles basales en ausencia de inducción de interferón, su expresión está altamente inducida por IFN-I o interferón-γ34. Descubrimos que el 95% de las células infectadas con CHIKV son positivas para el marcador IFITM3. Sin embargo, en ausencia del receptor de IFN-I (ratones Ifnar1 -/-), solo el 24,6% de las células infectadas con CHIKV se colocalizan con la señal IFITM3 (Figura complementaria 4a), lo que demuestra que la respuesta observada depende parcialmente de IFN- I. Se detectó la producción local de proteínas ISG15 e IFITM3 en el tejido cardíaco tras la infección por CHIKV en células vimentina+ tanto infectadas como no infectadas (Fig. 3b y Fig. complementaria 4a), lo que sugiere que los fibroblastos cardíacos, entre otras células vimentina+, son los principales respondedores al IFN-I. en tejido cardíaco infectado.

A continuación, intentamos determinar la importancia de la señalización de IFN-I en la infección de fibroblastos cardíacos humanos (hCF) por CHIKV. Evaluamos esto: (i) midiendo la capacidad de los hCF para generar una respuesta sólida de IFN-I después de la estimulación poli(I:C) y la infección por CHIKV; (ii) medir la susceptibilidad de estas células a la infección por CHIKV en ausencia de señalización de IFN-I utilizando el inhibidor de JAK1/JAK2 ruxolitinib (Rux); y (iii) inducir un estado refractario al aumentar dosis de pretratamientos con IFN-I. De hecho, encontramos que los hCF responden eficientemente a la estimulación poli (I: C), lo que da como resultado ~ 88% de la monocapa que expresa ISG15 (Fig. 3c, panel izquierdo). De acuerdo con nuestros datos in vivo, encontramos que los hCF infectados respondieron a la infección por CHIKV produciendo niveles significativos de ISG15 (Fig. 3c, panel izquierdo). Además, el tratamiento con Rux aumentó significativamente el porcentaje de células infectadas con CHIKV (Fig. 3c, panel derecho) y se correlacionó con una reducción de la producción de ISG15 (Fig. 3c, panel izquierdo). Además, encontramos que la adición exógena de IFNα o IFNβ previno la infección por CHIKV en forma de respuesta a la dosis, y el IFNβ mostró una mayor capacidad de bloqueo (Fig. 3d). Estos resultados respaldan que la señalización de IFN-I es fundamental para controlar la infección por CHIKV en fibroblastos cardíacos humanos.

Finalmente, evaluamos la contribución directa de la respuesta de IFN-I en el control de la infección cardíaca por CHIKV y la prevención del daño tisular mediante el uso de ratones Ifnar1-/-. Como se esperaba, observamos que en ausencia de señalización de IFN-I, la propagación de CHIKV y la producción de partículas infecciosas aumentaron en el tejido cardíaco de ratones Ifnar1 -/- en comparación con ratones WT inmunocompetentes (Fig. 3e y Fig. Suplementaria 4b). Este aumento en la producción de partículas infecciosas también se observó en el músculo de la pantorrilla, un sitio primario de infección por CHIKV, pero no se observó en un órgano que no es objetivo del CHIKV, como el páncreas (Figura complementaria 4b). Si bien los fibroblastos cardíacos (Vimentin+/aSMA-; 42%) todavía representan el objetivo principal de la infección por CHIKV en el tejido cardíaco en ratones Ifnar1-/-, observamos una mayor proporción de células endoteliales infectadas (CD31+; 16,5%, Fig. 3f, y Fig. complementaria 3c) en relación con WT (Fig. 1f). Curiosamente, en ratones Ifnar1 -/- solo el 7,8% de las células infectadas se colocalizaron con el marcador cTnT (Fig. 3f y Fig. complementaria 3c), lo que sugiere que incluso en ausencia de respuesta de IFN-I, los miocitos cardíacos no representan un objetivo. de la infección por CHIKV en ratones. Para determinar si el aumento de infección observado en ratones Ifnar1 -/- produce daño cardíaco incluso en ausencia de infección de miocitos cardíacos, evaluamos la apoptosis del tejido cardíaco mediante tinción con CASP3 escindido a 1 ppp. Observamos que, si bien la infección de ratones WT mostró niveles similares de señal de CASP3 escindida en comparación con el control infectado simuladamente, los ratones Ifnar1 -/- mostraron un nivel significativamente mayor de CASP3 escindida dentro del miocardio (Fig. 3g), lo que demuestra que la infección por CHIKV sin restricciones puede provocar daños en el tejido cardíaco. En conjunto, estos resultados demuestran que una respuesta local de IFN-I es esencial para controlar la infección por CHIKV en el corazón y prevenir el daño al tejido cardíaco.

La señalización de IFN-I se activa tras el reconocimiento del ARN de CHIKV a través de receptores citosólicos (RIG-I/MDA5) o endosómicos (TLR3/7)35. Para comprender mejor los mecanismos por los que el tejido cardíaco elimina la infección por CHIKV, aprovechamos ratones deficientes en los principales componentes de señalización inmune innata, incluidos MYD88, TRIF o MAVS. Además, para abordar la contribución del inflamasoma NLRP3 en la eliminación de CHIKV36,37 utilizamos ratones con deficiencia de CASPASE 1/11. Infectamos a cada ratón por vía intravenosa con CHIKV y evaluamos la carga viral en el tejido cardíaco a 2, 5 y 7 ppp. Curiosamente, si bien no encontramos diferencias significativas en la cinética de infección entre los ratones Myd88 -/-, Trif Lps2/Lps2 o Casp1/11-/- en comparación con los ratones WT, las partículas infecciosas fueron detectables hasta 7 ppp para los ratones Mavs-/- ( Figura 4a). De hecho, encontramos que la eliminación heterocigota de MAVS da como resultado un fenotipo similar al WT, lo que demuestra que se requiere la pérdida completa de MAVS para la persistencia de la infección por CHIKV (Figura complementaria 5a). Estos resultados sugirieron que la señalización de MAVS contribuye a la eliminación de la infección por CHIKV de los corazones infectados.

a Susceptibilidades diferenciales a la infección cardíaca por CHIKV entre ratones MyD88-/-, Trif Lps2/Lps2, Casp1/11-/-, Mavs-/- y WT. PESO: 2 ppp (n = 10), 5 ppp (n = 16) y 7 ppp (n = 6). Casp1/11−/−: 2 ppp (n = 5), 5 ppp (n = 8) y 7 ppp (n = 3). MyD88−/−: 2 ppp (n = 4), 5 ppp (n = 6) y 7 ppp (n = 3). Trif Lps2/Lps2: 2 ppp (n = 5), 5 ppp (n = 5) y 7 ppp (n = 4). Mavs−/−: 2 ppp (n = 4), 5 ppp (n = 4) y 7 ppp (n = 4). b, c Cinética de infección cardíaca por CHIKV en ratones Mavs-/- y WT. b WT: 2 ppp (n = 6), 5 ppp (n = 7), 7 ppp (n = 4), 10 ppp (n = 4) y 15 ppp (n = 2). Mavs−/−: 2 ppp (n = 5), 5 ppp (n = 6), 7 ppp (n = 10), 10 ppp (n = 8) y 15 ppp (n = 4). C. Peso: 2 ppp (n = 6), 5 ppp (n = 7), 7 ppp (n = 4), 10 ppp (n = 4) y 15 ppp (n = 2). Mavs−/−: 2 ppp (n = 5), 5 ppp (n = 6), 7 ppp (n = 8), 10 ppp (n = 5) y 15 ppp (n = 4). Genomas de ARN de CHIKV del corazón (d) y de homogeneizados de músculo de la pantorrilla (e). d HI-control (n = 6). Peso: 1 ppp (n = 5), 2 ppp (n = 6), 10 ppp (n = 4) y 15 ppp (n = 2). Mavs−/−: 1 ppp (n = 9), 2 ppp (n = 5), 10 ppp (n = 8) y 15 ppp (n = 4). e HI-control (n = 3). Peso: 2 ppp (n = 4), 10 ppp (n = 5) y 15 ppp (n = 3). Mavs−/−: 2 ppp (n = 4), 10 ppp (n = 8) y 15 ppp (n = 4). f Panel izquierdo: niveles de ARN de CHIKV en las secciones superior e inferior del corazón a 10 ppp. Control HI (n = 1), WT (n = 3) y Mavs−/− (n = 3). Panel derecho: proporción de niveles de ARN viral entre las secciones superior e inferior del corazón. N = 3/grupo. El conjunto de datos WT a 10 ppp se comparte con la Fig. 1c. g Niveles de expresión de Isg15 en corazones infectados con Mavs-/- y WT CHIKV. WT: control HI (n = 4), 12 hpi (n = 4), 24 hpi (n = 5) y 2 ppp (n = 6). Mavs−/−: control HI (n = 4), 12 hpi (n = 9), 24 hpi (n = 9) y 2 ppp (n = 7). Niveles de proteína de IFN-α e INF-β en corazón (h) y suero (i) a las 24 hpi. h. Control HI (n = 7), WT (n = 5) y Mavs−/− (n = 9). i. Control HI (n = 7), WT (n = 5) y Mavs−/− (n = 7). Los datos se muestran como media ± SEM (a, dg). Los diagramas de caja muestran la mediana y los rangos de cuartiles, los bigotes representan el rango (b, c, h, i). Los valores de P se calcularon mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas (a – i). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, ampliamos nuestro análisis en el corazón hasta 15 ppp y descubrimos que las partículas infecciosas se pueden detectar hasta 10 ppp (Fig. 4b), mientras que las partículas infecciosas en el suero se eliminaron en 5 ppp tanto para Mavs-/- como para WT. ratones (Fig. 4c). De acuerdo con esto, se detectaron células infectadas con CHIKV-ZsGreen hasta 10 ppp tanto en la región del miocardio como en los vasos en ratones Mavs -/- (Figura complementaria 5b, c). Para evaluar si esta deficiencia en la eliminación viral del tejido cardíaco se observa en otros tejidos, evaluamos los niveles de ARN de CHIKV en el músculo de la pantorrilla y el corazón a 2, 10 y 15 ppp tanto para ratones WT como para Mavs-/-. Descubrimos que la cinética de eliminación del CHIKV del músculo de la pantorrilla es diferente a la del tejido cardíaco. Para el tejido cardíaco, observamos una eliminación progresiva en los niveles de ARN de los ratones WT, mientras que para los ratones Mavs-/- observamos que los niveles de ARN viral se mantienen hasta 10 ppp, con niveles disminuidos observados a los 15 ppp (Fig. 4d). ). Sin embargo, en el músculo de la pantorrilla, tanto los ratones Mavs-/- como WT mostraron una reducción progresiva del ARN viral con el tiempo, y a 10 ppp no ​​se observaron diferencias significativas en el ARN de CHIKV (Fig. 4e). Curiosamente, cuando evaluamos los niveles de ARN de CHIKV en la sección superior o inferior del corazón a 10 ppp, observamos niveles de ARN viral más altos en las secciones superiores en relación con las secciones inferiores (Fig. 4f). Estos resultados concuerdan con nuestra observación en animales WT (Fig. 1d) y respaldan que las secciones del corazón enriquecidas en aurículas y/o vasos son más propensas a una infección sostenida con el tiempo. En conjunto, estos resultados demostraron que la detección a través de MAVS es necesaria para eliminar la infección por CHIKV del tejido cardíaco.

Es de destacar que encontramos que los corazones infectados con Mavs -/- indujeron niveles similares de ARNm de Isg15 en comparación con WT (Fig. 4g). A raíz de este resultado, medimos la producción local (homogenado de tejido cardíaco) y sistémica (suero) de IFNα o IFNβ a las 24 hpi, que corresponde al pico de inducción de Isg15 en el tejido cardíaco (Fig. 4g). Descubrimos que, si bien la producción local de IFN-I es baja en el tejido cardíaco (Fig. 4h), tanto los ratones WT como Mavs-/- producen niveles sistémicos significativos de IFNα e IFNβ (Fig. 4i). Sorprendentemente, los niveles sistémicos tanto de IFNα como de IFNβ fueron mayores en los ratones Mavs-/- en comparación con los WT (Fig. 4i), lo que se correlaciona con las cargas virales significativamente más altas observadas en los Mavs-/- (Fig. 4b y 4d, e). . Estos datos sugieren que el retraso en la eliminación de CHIKV no puede explicarse completamente por una inducción reducida de IFN-I asociada con Mavs-/-.

A continuación, intentamos determinar si la persistencia de la infección cardíaca por CHIKV en ratones Mavs-/- puede provocar daño al tejido cardíaco. Infectamos ratones Mavs-/-, Mavs+/- y WT por vía intravenosa con CHIKV y recolectamos el corazón para análisis histopatológico a 10 ppp (Fig. 5a, panel superior). Como era de esperar, no observamos ningún signo de inflamación en el tejido miocárdico ni en los ratones Mavs+/- ni en los WT (Fig. 5a, b y Datos complementarios 1). Sin embargo, el 53% de los ratones Mavs-/- infectados con CHIKV (7 de 13 ratones) desarrollaron miocarditis focal a 10 ppp (Fig. 5a-b y Datos complementarios 1). Sorprendentemente, encontramos que todos los ratones Mavs-/- infectados con CHIKV (13 de 13) tenían inflamación transmural de la pared de los vasos grandes unidos a la base del corazón (p. ej., aorta, arteria pulmonar) correspondiente a vasculitis de grandes vasos (Fig. 5a, cy Datos complementarios 1). Es de destacar que una fracción de los ratones WT y Mavs+/− mostraron signos mínimos de inflamación en los vasos correspondientes a la endotelialitis, caracterizada por una inflamación leve de la capa íntima del vaso (Fig. 5a, panel inferior). En conjunto, estos resultados demuestran que la persistencia de la infección por CHIKV en el tejido cardíaco puede provocar infiltrados inflamatorios que provoquen miocarditis focal y vasculitis de grandes vasos.

a Panel superior: Representación esquemática del diseño experimental. Panel inferior: H&E representativo de al menos cuatro ratones independientes que muestran corazones WT, Mavs+/− y Mavs−/− infectados con CHIKV a 10 ppp. Escala = 200 micras. El cuadrado negro indica la sección seleccionada (recuadros i y ii). Recuadro i: región del miocardio. Recuadro ii: grandes vasos adheridos a la base del corazón. Escala = 20 µm. b Cuantificación del número de ratones con signos positivos de miocarditis. Los datos representan el porcentaje de ratones con algún signo de miocarditis sobre la cantidad total de ratones analizados. WT (n = 4), Mavs+/− (n = 6) y Mavs−/− (n = 13). c Cuantificación del número de ratones con vasculitis de grandes vasos. Los datos representan el porcentaje de ratones con algún signo de vasculitis sobre la cantidad total de ratones analizados. WT (n = 4), Mavs+/− (n = 6) y Mavs−/− (n = 13). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen (relacionado con los datos complementarios 1).

Dada la miocarditis focal y la vasculitis de grandes vasos observada a 10 ppp en ratones Mavs-/-, nos preguntamos si esta infiltración puede provocar una inflamación crónica que podría provocar daño tisular a largo plazo. Para ello, se infectaron ratones Mavs-/- por vía intravenosa o subcutánea con CHIKV y se recogió tejido cardíaco para análisis histopatológico 2 semanas, 1 mes o 2 meses después de la infección. El tejido se tiñó con H&E y los infiltrados de células mononucleares se evaluaron en busca de marcadores CD3 y CD11b mediante IHC. Descubrimos que una fracción de ratones Mavs-/- desarrolló miocarditis focal y multifocal acentuada alrededor de los vasos en ratones infectados por vía de inoculación intravenosa o subcutánea (Fig. 6a, by Datos complementarios 1). Estos focos inflamatorios se caracterizaron por infiltrados de células CD11b+ y CD3+ y persistieron hasta 60 ppp o hasta 31 ppp en ratones infectados por vía intravenosa o subcutánea, respectivamente (Fig. 6b y Fig. Suplementaria 6a, b, e). Curiosamente, no detectamos cambios en los niveles séricos de troponina T cardíaca (Fig. 6c), lo que sugiere que a pesar de la miocarditis no hay daño significativo de los miocitos cardíacos en este modelo. Sorprendentemente, se detectó vasculitis de grandes vasos caracterizada por infiltrados transmurales de CD3 + y CD11b + hasta 60 ppp en ratones Mavs -/- infectados independientemente de la ruta de inoculación (Fig. 6d; Fig. 6c, d y Datos complementarios 1).

a Panel superior: Representación esquemática del diseño experimental. Panel inferior: secciones H&E representativas de al menos tres ratones independientes que muestran el miocardio de ratones Mavs-/- infectados con CHIKV subcutáneo o intravenoso a las 2 semanas, 1 mes o 2 meses después de la infección. Están indicados los vasos dentro de la región del miocardio. Escala = 20 µm. b Cuantificación del número de ratones con signos positivos de miocarditis tanto para la vía de inoculación intravenosa como subcutánea. Los datos representan el porcentaje de ratones con algún signo de miocarditis sobre la cantidad total de ratones analizados. Intravenoso: control PBS/HI (n = 4), 14/15 ppp (n = 10), 30 ppp (n = 5) y 60 ppp (n = 4). Subcutáneo: control PBS/HI (n = 2), 14 ppp (n = 3), 31 ppp (n = 3) y 60 ppp (n = 3). C. Niveles séricos de troponina T cardíaca medidos mediante ELISA PBS/HI-control (n = 7), 2 ppp (n = 8), 5 ppp (n = 8), 7 ppp (n = 8), 10 ppp (n = 5) y 15 ppp (n = 4). d. Representación esquemática del diseño experimental. Panel izquierdo: cuantificación del número de ratones con vasculitis de grandes vasos. Los datos representan el porcentaje de ratones con algún signo de vasculitis sobre la cantidad total de ratones analizados. Control HI (n = 3). Intravenoso: 15 ppp (n = 6), 30 ppp (n = 4) y 60 ppp (n = 4). Subcutánea: 14 ppp (n = 3), 31 ppp (n = 3) y 60 ppp (n = 3). Panel derecho: secciones representativas de H&E y CD3/CD11b IHC de al menos tres ratones independientes que muestran vasos adheridos a la base del corazón de ratones Mavs-/- infectados con CHIKV subcutáneos o intravenosos inoculados por vía subcutánea o intravenosa 2 semanas y 2 meses después de la infección. Escala = 20 µm. Los diagramas de caja muestran la mediana y los rangos de cuartiles, los bigotes representan el rango (c). Los valores de P se calcularon utilizando Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (c). Creado con BioRender.com. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Relacionado con los datos complementarios 1 y la figura complementaria 6.

Es de destacar que el tejido cardíaco de ratones Mavs-/- infectados que sucumbieron a la infección por CHIKV a 15 ppp (Tabla complementaria 1), mostró un daño tisular sustancial caracterizado por una calcificación distrófica de miocitos en parches que afecta a miocitos individuales y una miocarditis focal compuesta por infiltrados inflamatorios de CD11b+. y células CD3+, sin signos de fibrosis (Figura complementaria 7). En conjunto, estos resultados demuestran que la persistencia de la infección por CHIKV en el tejido cardíaco conduce a una inflamación crónica caracterizada por miocarditis focal o multifocal y vasculitis de grandes vasos.

En este estudio, definimos los mecanismos implicados en la infección del tejido cardíaco por CHIKV e identificamos factores del huésped involucrados en el desarrollo del daño del tejido cardíaco. Aquí demostramos: (i) que los fibroblastos cardíacos son un objetivo directo de la infección por CHIKV en un huésped inmunocompetente; (ii) que el tejido cardíaco provoca una respuesta local de IFN-I necesaria para la eliminación del CHIKV y la prevención del daño tisular; (iii) que, en ausencia de señalización MAVS, el CHIKV persiste en los corazones infectados, y (iv) que la falta de eliminación del CHIKV en ratones Mavs-/- conduce a miocarditis focal y vasculitis crónica de grandes vasos detectable hasta 60 ppp.

Estudios anteriores, incluido el nuestro, informaron la presencia de partículas infecciosas o ARN viral en tejido cardíaco no perfundido de ratones infectados con CHIKV19,20. Sin embargo, debido a la falta de perfusión y a los altos niveles de CHIKV en circulación, seguía siendo difícil determinar si el tejido cardíaco es un objetivo directo de la infección por CHIKV. Aquí, al incluir un paso de perfusión y utilizar enfoques experimentales ortogonales, demostramos que CHIKV se replica activamente en el tejido cardíaco de ratones inmunocompetentes independientemente de la ruta de infección. Además, demostramos que CHIKV infecta fibroblastos cardíacos y que su infección sigue un patrón discreto y focalizado dentro de los ventrículos, las aurículas, las válvulas y la región perivascular. Descubrimos que los fibroblastos cardíacos humanos primarios son susceptibles y permisivos al CHIKV. De hecho, el antígeno CHIKV en fibroblastos cardíacos se identificó previamente en necropsias humanas de individuos que murieron a causa de CHIKV12. Por tanto, nuestros resultados en modelos murinos son consistentes con el tropismo observado en necropsias humanas.

Demostramos que en ratones WT, CHIKV se elimina del tejido cardíaco dentro de la primera semana de la infección sin causar daño tisular. Nuestros datos de RNA-seq revelaron que el tejido cardíaco infectado muestra una regulación positiva de la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa y las vías de señalización de IFN-I, similar a lo que se ha descrito para el tejido infectado por CHIKV en la almohadilla plantar y los ganglios linfáticos. Además, encontramos que los genes previamente asociados con la protección del tejido cardíaco y el metabolismo antioxidante (Apod, Aft5, Fgf21 y Mthfd2) estaban regulados positivamente a los 2 ppp39,40. Apod es un gen cardioprotector cuya expresión se induce en corazones de ratón durante el infarto de miocardio y se ha propuesto para proteger el corazón contra el daño isquémico28. Además, se ha informado que Apod es el gen con regulación positiva más significativa en el tejido cardíaco infectado con SARS-CoV-2 en casos fatales de COVID-1941 y se ha encontrado que está regulado positivamente en un grupo de fibroblastos cardíacos durante la infección por Coxsackievirus B342. Se requieren más estudios para determinar el papel específico de Apod en la cardioprotección durante la infección por CHIKV.

Curiosamente, utilizando los conjuntos de datos de KEGG observamos una regulación positiva de la vía de la miocarditis viral y una regulación negativa de la vía de contractilidad del tejido cardíaco a 5 ppp (Figura complementaria 3c, g – i; Tabla complementaria 4). Sin embargo, no observamos signos de daño al tejido cardíaco mediante histopatología (Datos complementarios 1), lo que sugiere que la infección por CHIKV está desencadenando programas transcripcionales involucrados en la disfunción cardíaca que no son suficientes para dar lugar a fenotipos manifiestos de daño cardíaco.

Descubrimos que los corazones infectados por CHIKV muestran una producción significativa pero transitoria de quimiocinas y citocinas proinflamatorias, y una inducción de proteínas IFITM3 e ISG15 en células cardíacas vimentina+ tanto infectadas por CHIKV como en las no infectadas. Curiosamente, se ha demostrado que tras la estimulación de los TLR o del receptor tipo RIG-I, los fibroblastos cardíacos humanos pueden producir citoquinas proinflamatorias e inducir una respuesta inmune antiviral43. Nuestro estudio confirma el papel fundamental de la señalización de IFN-I en el control de la infección por CHIKV en fibroblastos cardíacos humanos. En el contexto de un huésped inmunocompetente, el tejido cardíaco infectado genera una respuesta fuerte y local de IFN-I que resuelve la infección por CHIKV en cuestión de días, con poco o ningún daño cardíaco. Esta observación proporciona una explicación de por qué la manifestación cardíaca del CHIKV no es un resultado generalizado en los individuos infectados por el CHIKV.

En consonancia con esto, un informe que utilizó ratones KO de 12 días de edad para una proteína implicada en la producción de IFN-β durante la infección por CHIKV (GADD34) reveló un aumento significativo de partículas virales en el corazón y el desarrollo de miocarditis en comparación con WT21. Se describieron resultados similares para ratones IFITM3 KO durante la infección por el virus de la influenza44. Por lo tanto, el riesgo de complicaciones cardíacas en pacientes infectados por CHIKV podría estar asociado con factores genéticos y no genéticos (como coinfecciones, dieta, entre otros) que conducen a una respuesta reducida del IFN-I. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en TLR3 encontrados en pacientes con miocarditis por enterovirus se asocian con una disminución de la señalización mediada por TLR3 y muestran una respuesta alterada de IFN-I después de la infección por Coxsackievirus B345. Por lo tanto, los SNP en IFN-I y los genes implicados en la señalización de MAVS podrían ser la base de una mayor susceptibilidad a complicaciones cardíacas en pacientes infectados por CHIKV. Los SNP en la región codificante del gen MAVS humano pueden provocar un deterioro de la función46,47. Además, estudios recientes sugirieron un vínculo entre la edad y la disminución de la detección a través de MAVS48, lo que podría ser un factor que contribuya a la correlación observada entre la edad y la gravedad del CHIKV5,15. El trabajo adicional debería centrarse en determinar si la variabilidad en la señalización de IFN-I y MAVS entre individuos puede explicar las susceptibilidades diferenciales a las complicaciones cardíacas inducidas por CHIKV.

Múltiples PRR participan en el control in vivo de la infección por CHIKV30. Aquí, demostramos que la eliminación de CHIKV del tejido cardíaco infectado depende de MAVS, pero es independiente de MYD88, TRIF o el inflamasoma NLRP3. Sin embargo, encontramos un número reducido de partículas infecciosas aisladas de corazones infectados de ratones Casp1/11-/- y Myd88-/- en comparación con WT, lo que sugiere que el inflamasoma NLRP3, así como la señalización a través de TLR7, pueden desempeñar un papel en los primeros pasos de Infección cardíaca por CHIKV. Demostramos que en ausencia de MAVS, CHIKV persiste en el tejido cardíaco. Curiosamente, los niveles sistémicos de IFNα e IFNβ fueron significativamente más altos en los ratones Mavs-/- en comparación con los WT, y se correlacionaron directamente con las cargas virales observadas en los Mavs-/-. Múltiples PRR están involucrados en la producción de IFN-I y en la protección asociada con la infección por alfavirus31,49, lo que sugiere que otros PRR, como TLR3 o TLR7, pueden contribuir al rescate de la producción sistémica de IFN-I en este modelo50. De acuerdo con esto, encontramos que los corazones infectados en ratones Mavs-/- muestran niveles similares de Isg15 local en comparación con WT, lo que indica que el tejido cardíaco responde al IFN-I en ausencia de señalización MAVS. Estos hallazgos intrigantes sugieren que la eliminación de CHIKV del tejido cardíaco en ratones Mavs-/- no depende completamente de una producción local deficiente de IFN-I. La infección persistente por CHIKV en el tejido cardíaco podría estar asociada con los efectos de otros mediadores posteriores al MAVS, como la vía NFKβ51. Además, es posible que la contribución de la señalización MAVS en la eliminación de la infección por CHIKV del tejido cardíaco esté asociada con etapas tardías de la infección viral, que pueden ocurrir después de que la respuesta sistémica de IFN-I alcance niveles insignificantes. En apoyo de esto, observamos una pendiente positiva en la detección de genomas de CHIKV entre 2 y 10 ppp (Fig. 4d), lo que sugiere que la replicación viral activa en Mavs -/- muestra una cinética diferente en comparación con WT. Los estudios futuros se centrarán en determinar los mecanismos implicados en la interacción entre la señalización MAVS y la persistencia viral de CHIKV en el tejido cardiovascular. Es importante señalar que otra posible explicación para nuestros resultados puede estar asociada, en parte, con la naturaleza general de nuestro estudio. El análisis masivo no proporciona la resolución para definir los efectos locales asociados a las respuestas específicas de los Mavs-/-. Un ejemplo de esto último se observó en cerebros infectados por el virus de la fiebre del Valle del Rift, en los que no se observaron diferencias en la inducción global de la señalización de IFN-I entre Mavs-/- y WT mediante RNA-seq52 en masa, pero se hicieron evidentes cuando se analizaron. con resolución unicelular52. Recientemente se han aplicado tecnologías unicelulares al estudio del tejido cardíaco y de la miocarditis viral42. Por lo tanto, los estudios sobre tejido cardíaco infectado por CHIKV a nivel unicelular pueden ayudar a dilucidar el papel de los efectos celulares locales en la eliminación de CHIKV.

Los ratones Mavs-/- muestran diferentes susceptibilidades a alfavirus artritogénicos relacionados30,53. Mientras que los ratones Mavs-/- infectados con el virus del río Ross desarrollaron una enfermedad grave y sucumbieron a la infección después de 8 ppp53, los ratones infectados con CHIKV sobrevivieron cuando se les inoculó por vía subcutánea30 (Tabla complementaria 1). Los estudios comparativos que aborden el papel de PRR en el control de la infección de alfavirus artritogénicos relacionados serían fundamentales para ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos de patogénesis específicos de los virus.

Demostramos que la infección por CHIKV provocó miocarditis focal y multifocal en ratones Mavs-/-. Sin embargo, los niveles séricos de cTnT permanecieron inalterados, lo que respalda la ausencia de daño a los miocitos cardíacos. Descubrimos que CHIKV no infecta miocitos cardíacos en ratones, lo que coincide con la falta de evidencia de infección de miocitos cardíacos en muestras de tejido cardíaco post mortem humanos12. Sin embargo, se han observado niveles elevados de troponinas cardíacas en individuos con manifestaciones cardíacas asociadas al CHIKV6,7,13,16, lo que plantea la posibilidad de que, bajo ciertas condiciones, el CHIKV pueda inducir daño a los miocitos cardíacos. Otra alternativa es que los miocitos cardíacos humanos y murinos tienen diferentes susceptibilidades a la infección por CHIKV. Se requieren más estudios que utilicen explantes de tejido cardíaco humano u organoides de cardiomiocitos humanos para evaluar la susceptibilidad relativa de los miocitos cardíacos humanos a la infección por CHIKV.

Finalmente, descubrimos que la infección por CHIKV provocaba una inflamación vascular crónica en los grandes vasos adheridos a la base del corazón. Esta inflamación crónica en la vasculatura es intrigante y destaca la propia vasculatura como un nicho potencial para la infección por CHIKV. De hecho, detectamos un comportamiento diferencial en las susceptibilidades de CHIKV entre las secciones superior e inferior del corazón, y se detectó replicación activa de CHIKV en células dentro de vasos de hasta 10 ppp en Mavs-/-. Estos resultados demuestran que la infección persistente en el tejido cardíaco conduce a inflamación cardíaca y potencialmente daño al tejido cardíaco, y resalta un riesgo potencial de desarrollar daño vascular a largo plazo asociado con la infección por CHIKV.

En general, este estudio demuestra la causalidad directa entre la replicación activa del CHIKV en el corazón y el desarrollo de manifestaciones cardiovasculares. Los estudios futuros centrados en las manifestaciones atípicas de las enfermedades arbovirales y su patogénesis son fundamentales para comprender el espectro completo de las consecuencias de estas infecciones. Este conocimiento es fundamental para el seguimiento de manifestaciones atípicas en áreas endémicas, así como en futuras epidemias. A su vez, esto podría aprovecharse para el diagnóstico temprano, la prevención y las intervenciones terapéuticas, especialmente en áreas endémicas donde la circulación de estos virus representa una carga para la salud pública54,55. En conjunto, aquí brindamos información mecanicista sobre cómo CHIKV puede provocar daño cardíaco, subrayando la importancia de monitorear la función cardíaca en pacientes con infecciones por CHIKV y sentando las bases para el desarrollo de nuevos enfoques para prevenir complicaciones cardíacas inducidas por virus.

El trabajo con CHIKV se realizó en un laboratorio de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York.

Las células se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5%. Los riñones de hámster bebé (BHK-21, ATCC CCL-10) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Corning) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS; Atlanta Biologicals) y 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA, Gibco). Se cultivaron células Vero (ATCC CCL-81) en DMEM con suero de ternera recién nacido al 10% (NBCS; Gibco). Se obtuvieron células cardíacas primarias humanas de PromoCell, se utilizaron hasta el paso 10 y se cultivaron siguiendo las recomendaciones de la empresa. Se cultivaron fibroblastos cardíacos humanos (C-12375), células endoteliales microvasculares cardíacas humanas (C-12285) y miocitos cardíacos humanos (C-12810) en medio de crecimiento de fibroblastos 3 (PromoCell, C-23025), medio de crecimiento de células endoteliales MV ( PromoCell, C-22020) y Myopathy Growth Media (PromoCell, C-22070), suplementados con penicilina-estreptomicina al 1% (Cellgro, 30-002-CI), respectivamente. Todos los tipos de células se confirmaron libres de micoplasma utilizando el kit de detección por PCR Lookout Mycoplasma (Sigma-Aldrich).

Se generaron clones infecciosos de CHIKV (cepa CHIKV 06-049; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM258994) y CHIKV reporter (CHIKV-ZsGreen; CHIKV cepa 06-049) como se describió anteriormente20,56. Rescate de virus de clones infecciosos. Brevemente, se linealizaron 10 μg de cada uno de los plásmidos de los clones de infección durante la noche con NotI (Thermo-Scientific) a 37 °C, se extrajeron con fenol:cloroformo, se precipitaron con etanol y se resuspendieron en agua libre de nucleasas a 1 μg/μl. Los ARN virales transcritos in vitro se produjeron utilizando el kit SP6 mMESSAGE mMACHINE (Ambion) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la síntesis de ARN, las muestras se trataron con ADNasa y los ARN se purificaron mediante extracción con fenol: cloroformo, precipitación con etanol y se resuspendieron en agua libre de nucleasas a una concentración de 1 μg/μl. La integridad del ARN se confirmó mediante electroforesis en gel (1% de agarosa). Se dividieron alícuotas de ARN y se almacenaron a -80 °C hasta la electroporación. El virus infeccioso se produjo electroporando células BHK con ARN virales transcritos in vitro. Para ello, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces con DPBS enfriado con hielo (Corning) y se resuspendieron a 1 x 107 células/ml en PBS. Se mezclaron 390 µl de células con 10 µg de ARN transcrito in vitro y se agregaron a una cubeta de electroporación de 2 mm (BioRad). Las células BHK-21 se electroporaron con 1 pulso a 1,2 kV, 25 μF, con resistencia infinita. Se permitió que las células se recuperaran durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT), se transfirieron a 6 ml de DMEM tibio suplementado con 10% de FBS y 1% de NEAA y se colocaron en un matraz T25 a 37 °C durante 72 h. Se recogió el virus, se clarificó a 1200 x g durante 5 minutos y se usaron 3 ml de los sobrenadantes clarificados para infectar el matraz T175 para generar reservas de trabajo (Pasaje 1). Los títulos virales se determinaron mediante ensayo de placas en células Vero. Para generar virus inactivado por calor (HI), se incubaron reservas de virus con títulos de 106 PFU/ml en un baño de agua a 56 °C durante 4 h. Los títulos virales y la pérdida de infectividad del virus HI se confirmaron mediante ensayo de placa en células Vero (ver más abajo).

Se agregaron diluciones de diez veces de cada virus en DMEM a una monocapa de células Vero durante 1 h a 37 °C. Después de la incubación, las células se cubrieron con agarosa al 0,8% en DMEM que contenía NCBS al 2% y se incubaron a 37 °C durante 72 h. Las células se fijaron con formalina al 4%, se retiró el tapón de agarosa y las placas se visualizaron mediante tinción con violeta cristal. Los títulos se determinaron contando las placas en la dilución contable más alta.

Se sembraron células cardíacas primarias humanas en placas negras transparentes planas de 96 pocillos (Corning, 07200588) a una densidad de 18.000 células/pocillo. Después de 24 h, las células se trataron de la siguiente manera: (i) estimulación con poli (I:C) in vitro, (ii) tratamiento con ruxolitinib o (iii) tratamiento simulado. Para la estimulación con poli(I:C), se transfectaron fibroblastos cardíacos humanos en placas de 96 pocillos con 62 ng de poli(I:C) de alto peso molecular (InvivoGen) utilizando el kit de transfección de ARNm TransIT (Mirus Bio), o se trataron con TransIT. transfección sola (control de portadores). Después de 2 h, las células se lavaron y se usaron para experimentos posteriores. Para la condición de ruxolitinib, las células se trataron previamente con ruxolitinib 5 μM (Invitrogen, INCB018424) o se trataron de forma simulada durante 3 h, las células se lavaron y se usaron para experimentos posteriores. Las células pretratadas con poli(I:C), ruxolitinib o tratadas de forma simulada se infectaron luego con CHIKV-ZsGreen a una MOI de 0,25 o se infectaron de forma simulada con DMEM durante 1 h a 37 °C. Después de 1 h, se eliminó el inóculo, las monocapas se lavaron una vez con PBS frío y se agregaron a las células 100 µl de medio de crecimiento de fibroblastos 3 (PromoCell, C-23025). Se añadió medio de crecimiento de fibroblastos 3 con ruxolitinib 5 µM a las células para la condición de ruxolitinib. Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Las células se fijaron con formalina al 10% durante 1 h y se tiñeron para microscopía (ver más abajo).

Se sembraron células cardíacas primarias humanas en placas negras transparentes planas de 96 pocillos (Corning, 07200588) a una densidad de 18.000 células/pocillo. Después de 24 h, las células se estimularon con las concentraciones indicadas de IFNα A/D (Millipore Sigma, #I4401) o IFNβ (Millipore Sigma, #IF014) durante 24 h. Las células pretratadas con IFN o tratadas de forma simulada se infectaron con CHIKV-ZsGreen a una MOI de 0,25 o se infectaron de forma simulada con DMEM durante 1 h a 37 °C. Después de 1 h, se eliminó el inóculo, las monocapas se lavaron una vez con PBS frío y se agregaron a las células 100 µl de medio de crecimiento de fibroblastos 3 (PromoCell, C-23025). Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Las células se fijaron con formalina al 10% durante 1 h y se tiñeron para microscopía (ver más abajo).

Después de la fijación, las células se lavaron dos veces con PBS, se permeabilizaron con Triton-X/PBS al 0,1% (Fisher, 9002-93-1) durante 10 minutos y se lavaron nuevamente con PBS. Para los experimentos de pretratamiento con IFN-I recombinante, las células se tiñeron con DAPI (Thermo) a una dilución de 1:1000 durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Para los experimentos de respuesta in vitro, las células se bloquearon durante la noche en BSA/PBS al 1% a 4 °C. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-ISG15 (ProteinTech, 15981-1-AP) a una dilución de 1:100 en BSA/PBS al 0,1% durante 1 h a 37 °C y se lavaron tres veces con PBS. Las células se tiñeron con anticuerpo secundario AF555-anti-Conejo (Invitrogen) y DAPI (Thermo) a una dilución 1:1000 durante 1 h a 37 °C y se lavaron tres veces con PBS. Se tomaron imágenes de las placas utilizando la plataforma de detección de alto contenido CellInsight CX7 (Thermofisher) con el objetivo 4x en 9 campos que cubrían completamente cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El software de alto contenido se utilizó para microscopía y análisis de imágenes.

El Departamento de Salud de Nueva York recolectó huevos de Aedes (Ae.) albopictus de la planta de tratamiento de aguas residuales de la isla Tallman en Queens, ciudad de Nueva York57. Los mosquitos se criaron y mantuvieron en cámaras humidificadas de Memmert a 28 °C con 70% de humedad y un ciclo de luz diurno de 12 h. Todos los estudios de transmisión se realizaron con mosquitos de la generación F7. Infección por mosquitos. Ae. Los mosquitos albopictus de Tallman (F7) fueron expuestos a una alimentación de sangre artificial que contenía 1E6 UFP/ml de CHIKV. Brevemente, los virus se mezclaron 1:2 con sangre de oveja lavada con PBS (Fisher Scientific) suplementada con ATP 5 mM. Se utilizaron mosquitos expuestos a ingestión de sangre no infecciosa como controles no infectados. A las hembras de mosquitos se les permitió alimentarse de sangre a 37 °C a través de una membrana artificial durante 60 a 90 minutos. Las hembras hinchadas se identificaron, clasificaron e incubaron a 28 °C con 10% de sacarosa ad libitum durante 7 días. Antes de la transmisión, los mosquitos estuvieron privados de alimento durante 12 h.

Los ratones se mantuvieron a 21–23 °C con 30–70% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en una instalación libre de patógenos en la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York. Las tasas de intercambio de aire en las habitaciones de las viviendas se establecen entre 10 y 15 cambios de aire por hora. Los ratones reciben comida y agua ad libitum. Todos los ratones se alojan en jaulas ventiladas individualmente en autoclave (Tecniplast, West Chester, PA) con 50 a 70 cambios de aire del volumen de la jaula cada hora. Los animales experimentales se alojaron en grupos de hasta 5 ratones por jaula. Los ratones se criaron y cultivaron en casa y se mantuvieron en las mismas instalaciones en condiciones específicas libres de patógenos, incluidas las siguientes cepas: ratones de tipo salvaje C57BL/6J (000664, Jackson Laboratories). ratones de tipo salvaje C57BL/6(027) (Charles River Laboratories), Ifnar1-/- (028288, Jackson Laboratories); Myd88-/- (009088, Laboratorios Jackson); Casp1/11-/- (016621, Laboratorios Jackson); Mavs−/− (008634, Jackson Laboratories), Trif Lps2/Lps2 (005037, Jackson Laboratories). Todos los ratones se criaron como heterocigotos para generar controles de compañeros de camada WT y KO, y para los experimentos se utilizaron colonias WT o KO posteriores provenientes de controles de compañeros de camada.

Los experimentos con animales se realizaron en las instalaciones de Nivel de Bioseguridad Animal 3 (ABSL3) de la Facultad de Medicina Grossmann de la NYU, de acuerdo con todas las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Grossman de la NYU y de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud, la Ley de Bienestar Animal y la Ley Federal de EE. UU. El estudio recibió la aprobación ética de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York (IACUC) según el protocolo IACUC n.° IA16-01783. En todos los experimentos se utilizaron animales experimentales de ambos sexos, con la excepción de los experimentos de secuenciación de ARN en masa en los que utilizamos ratones macho. Para RNA-seq a granel utilizamos ratones machos para minimizar el posible efecto por lotes debido a las diferencias de género. Las infecciones se llevaron a cabo mediante inoculación subcutánea, picadura de mosquito o inyección intravenosa a través de inyecciones en la vena de la cola. Brevemente, se infectaron machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad con 1E5 UFP de CHIKV, CHIKV-ZsGreen o se les infectó de forma simulada con un portador (PBS o DMEM) o un inóculo similar de virus inactivado por calor (HI). Para la inoculación subcutánea, los ratones se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (Henry Schein Animal Health) y se les inyectaron 50 µl de virus o control en la almohadilla plantar trasera izquierda. Para la inoculación intravenosa, los ratones fueron inmovilizados y se les inyectó mediante inyección en la vena de la cola 100–200 μl de virus o inóculo de control utilizando una jeringa de insulina de 29 G (Fisher Scientific). Para la transmisión natural, los ratones se inmovilizaron sobre un vaso de medio litro cubierto de malla que contenía de 4 a 8 mosquitos infectados o no infectados (solo con sangre) por CHIKV, y se permitió que los mosquitos se alimentaran durante 40 minutos. Posteriormente, se devolvieron los ratones a sus jaulas, se mataron y homogeneizaron los mosquitos y se determinaron los títulos virales de los mosquitos infectados mediante un ensayo de placa. Los ratones experimentales infectados fueron sacrificados en diferentes momentos posteriores a la infección mediante inhalación de CO2. Se recogió sangre mediante punción cardíaca y los ratones se diseccionaron inmediatamente para realizar perfusión transcardíaca. Los ratones fueron perfundidos con 30 ml de PBS frío con una aguja de 21–23 G. La calidad de la perfusión cardíaca se evaluó confirmando la extracción total de sangre en el hígado y los riñones. Luego, se extrajeron los corazones y se colocaron en una placa de 12 pocillos con 1 ml de PBS. Cada corazón se abrió en cuatro cámaras y se confirmó que no tenía ningún coágulo de sangre. Todos los ratones de este estudio fueron perfundidos con excepción de los utilizados para histopatología e inmunotinción. El corazón, el músculo de la pantorrilla y el páncreas se recogieron en 500 µl de PBS que contenía una (corazón y páncreas) o dos (músculo de la pantorrilla) perlas de acero inoxidable de 5 mm (QIAGEN), se homogeneizaron con TissueLyser II (QIAGEN) a 30 1/s durante 2 min. (corazón y páncreas) o 4 min (músculo de la pantorrilla). Los desechos se eliminaron mediante centrifugación a 6010 × g durante 8 minutos. La sangre se recogió en tubos de 1,5 ml que contenían 20 µl de EDTA 0,5 M y se centrifugó a 6010 x g durante 8 minutos. Los títulos virales se cuantificaron mediante ensayo de placa en células Vero o TCID50 en células BHK-21.

Brevemente para la determinación de TCID50, se sembraron células BHK-21 en placas de 96 pocillos (10.000 células/pocillo). Para muestras de corazón, músculo y páncreas la dilución inicial corresponde a una dilución 1:5 del homogeneizado original, para suero la dilución inicial fue 1:20. Después de la primera dilución, se realizaron diluciones diez veces mayores de homogeneizados de tejido o suero en DMEM suplementado con un 1% de antibiótico-antimicótico (Anti-Anti, Invitrogen). Las monocapas se infectaron con 50 µl de las diluciones. Después de 1 h, se agregaron a cada pocillo 100 μl de DMEM + 10% FBS + 1% Anti-Anti. Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 96 h. Las placas se inspeccionaron bajo el microscopio en busca de evidencias de efecto citopático (CPE). Se utilizó tejido no infectado como control negativo y en cada placa se incluyeron pocillos tratados de forma simulada. Pozos positivos, corresponde a cualquier pozo que muestre CPE específico de CHIKV. Pozos negativos, corresponde a cualquier pozo sin CPE. Después de la incubación, las células se fijaron con formalina al 10% y se visualizaron bajo el microscopio. Cada muestra se midió en 6 o 7 réplicas técnicas y el cálculo se realizó utilizando la calculadora TCID50 en línea (https://www.klinikum.uni-heidelberg.de).

Las extracciones de ARN se realizaron utilizando el reactivo TRIzolTM (Invitrogen, se agregaron 200 µl de homogeneizado de tejido clarificado a 500 µl de TRIzolTM) siguiendo las pautas del fabricante. El ARN extraído se cuantificó y se diluyó a 200 ng/μl. Para los ensayos Taqman, se generó una curva estándar que abarca un rango de 100 ng/μl a 1E-6 ng/μl de ARN viral de CHIKV para cada conjunto de datos utilizando ARN de CHIKV transcritos in vitro como se describe anteriormente. Para los diferentes tejidos, optimizamos la cantidad de ARN viral total para que esté dentro del rango lineal de la curva de calibración. El número de ARN de CHIKV genómico (nsp4) o subgenómico (E1) se cuantificó mediante RT-qPCR utilizando 0,25-1 μg de ARN total como plantilla y el kit Taqman RNA-to-CT One-Step (Applied BiosystemsTM) en una reacción total. Volumen de 25 µl/pocillo. Se utilizaron los siguientes cebadores y sondas: cebadores CHIKV para amplificar el fragmento nsP4 (CHIKV directo (IOLqPCR6856F): 5′-TCACTCCCTGCTGGACTTGATAGA-3′ inverso (IOLqPCR6981R): 5′-TTGACGAACAGAGTTAGGAACATACC-3′) y una sonda (5′-(6 -carboxifluoresceína)-AGGTACGCGCTTCAAGTTCGGGCG-(black-holequencher)-3′). Cebadores CHIKV para amplificar el fragmento E1 (CHIKV adelante (IOLqPCR10865F): 5ʹ-TCGACGCGCCCTCTTTAA-3ʹ); reverso (IOLqPCR10991R): 5ʹ-ATCGAATGCACCGCACACT-3ʹ y una sonda (5ʹ-/56-FAM/ACCAGCCTG/ZEN/CACCCATTCCTCAGAC/3IABkFQ/-3ʹ). La concentración final de cebador y sondas fue de 1 μM y 0,6 μM, respectivamente. La transcripción inversa se llevó a cabo en el instrumento qPCR QuantStudio 3 utilizando el siguiente protocolo: 48 °C durante 30 min, seguido de 10 min a 95 °C. La amplificación se realizó durante 40 ciclos de la siguiente manera: 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min. Para las cuantificaciones de Sybr green, los niveles de Isg15, Apod, Ccl5 e Ifitm3 en homogeneizados de corazón se midieron mediante SYBR Green Master Mix (Thermo) y siguiendo las instrucciones del fabricante en un instrumento qPCR QuantStudio 3. Brevemente, la síntesis de ADNc se realizó en muestras de ARN purificadas como se describe anteriormente usando el kit Maxima H minus-strand (Thermo Scientific) y cebadores aleatorios, usando el siguiente protocolo: 25 °C durante 10 min, 50 °C durante 30 min y 85 ºC durante 5 min. La amplificación se realizó durante 40 ciclos de la siguiente manera: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min. La curva de fusión se evaluó para cada reacción. Cebadores: Isg15 (fw:5′-GGTGTCCGTGACTAACTCCAT-3′ y rv:5′-TGGAAAGGGTAAGA CCGTCCT-3′), Apod (fw:5′-CTGGGTGGAAACTTCAGTCATCTGATCT-3′ y rv:5′-CGCCAGGCGTGGCCAGGAAC-3′) , Ccl5 (fw:5'-TGCCCACGTCAAAGGAGTATTTC-3' y rv:5′-TCCTAGCTCATCTCCAAATAGTTGATG-3′), Ifitm3 (fw:5′-TTCAGTGCTGCCTTTGCTC-3′ y rv:5′-CCTTGATTCTTTCGTAGTTTGGGG-3′) y 18S (fw:5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, y rv:5′-CCATCCAA TCGGTAGTAGCG-3′). Los datos de RT-qPCR se recopilaron utilizando el software QuantStudio v1.4. La expresión relativa de los genes respectivos a la expresión de 18S se calculó utilizando el método ΔΔCT, y los valores se expresaron como cambio de veces normalizado al control infectado simulado. El ΔΔCT para cada muestra (infectada y simulada) se calculó frente al promedio de todos los valores de ΔCT calculados para la condición simulada.

Para la secuenciación masiva de ARN, se infectaron ratones macho C57BL/6 por vía intravenosa con 1E5 PFU de control CHIKV o HI, y los corazones se perfundieron con 30 ml de PBS y se recogieron a 2 y 5 ppp. Los corazones se recogieron en 500 µl de TRIzolTM (Invitrogen) con una perla de acero inoxidable de 5 mm y se procesaron como se describe anteriormente. El ARN se extrajo utilizando el kit de purificación de ARN Zymo direct-zol (Zymo research, n.º R2072) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se envió un total de 500 ng por muestra al Centro de Tecnología del Genoma de la Universidad de Nueva York para evaluación de control de calidad, ARN total cadenado TruSeq automatizado, con preparación de biblioteca RiboZero Gold y secuenciación Illumina Novaseq6000 (par único 100). Los archivos FASTQ se alinearon con un archivo concatenado que contenía el genoma del ratón (versión mm10) y el genoma de CHIKV (AM258994) a través de STAR (v2.5.2) en modo básico de dos pasadas utilizando la anotación de transcripción gencode (vM25). Se agregaron coordenadas de poliproteína de CHIKV estructurales y no estructurales (CHIKVgp1 y CHIKVgp2) a la anotación del transcriptoma, y ​​la matriz de recuento de transcritos se generó utilizando la función de resumen de superposiciones del paquete Genomic Alignments (v1.22.1). El análisis diferencial de la expresión génica basado en la distribución binomial negativa se realizó utilizando DEseq2 (v1.26.0). Para el análisis de enriquecimiento de rutas, los genes se clasificaron según los valores −Log10 (FDR), asignando un valor positivo o negativo según la dirección del cambio. Las listas de rutas se obtuvieron del paquete msigdbr (v7.2.1) (Hallmark, REACTOME o KEGG) y se utilizaron como entrada para el análisis de enriquecimiento de rutas GSEA a través del paquete fgsea (v1.12.0) R. Los gráficos de volcanes se generaron usando ggplot2 (v3.3.3) y los mapas de calor se generaron usando pheatmap (v1.0.12).

Se extrajeron los corazones de los ratones sacrificados y se fijaron en PFA, lisina y tampón periodato (tampón fosfato 0,05 M, L-lisina 0,1 M, pH 7,4, NaIO4 2 mg/ml y paraformaldehído 10 mg/ml) a 4 °C durante 24 h. . A continuación, los tejidos se deshidrataron en sacarosa al 30% durante la noche a 4 °C y posteriormente se incluyeron en medio OCT. Se cortaron secciones de tejido congelado con un espesor de 5 μm en el Laboratorio de Investigación de Patología Experimental de la Universidad de Nueva York. Los receptores Fc se bloquearon con un anticuerpo bloqueante Fc anti-CD16/32 al 0,5 % (Biolegend, clon 93) diluido en PBS que contenía suero de cabra al 2 % (Vector Laboratories, S-1000), FBS al 2 % (Atlanta) y Triton-X al 0,25 %. 100 (Fisher, BP151-100) durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron 5 veces con el mismo tampón y se trataron con un desactivador de autofluorescencia Trueblack Lipofuscin (Biotium, CAT23007) en etanol al 70 % (5 % v/v) durante 1 min. Las secciones se lavaron 5 veces y se tiñeron con eF570-αSMA (Invitrogen, clon: 1A4) con APC-CD45 (BioLegends, clon: 30-F11), AF647-TNT (BD Pharmingen, clon: 13-11), AF647-CD31 (BioLegends, clon: MEC13.3) o AF647-Vimentin (Abcam, clon: EPR3776) durante 1 h, a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos se utilizaron en una dilución 1:100. Para la tinción con IFITM3 o ISG15, los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo anti-Fragilis 1:100 (Abcam, ab15592, policlonal) o anticuerpo anti-ISG15 1:100 (Invitrogen, PA5-79523, policlonal) durante 1 hora a temperatura ambiente, respectivamente; se lavó y se tiñó con un anticuerpo secundario AF555-anti-Conejo (Invitrogen) a una dilución 1:1000 durante 1 h. Luego, todos los portaobjetos se tiñeron con DAPI (Thermo) a una dilución 1:1000. Las secciones se lavaron con el mismo tampón y montaje para análisis microscópico. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss).

Los datos de imágenes se procesaron y analizaron utilizando el software Imaris versión 9.8 (Bitplane; Oxford Instruments). Brevemente, se construyeron superficies para cada canal utilizando un umbral específico, número de vóxeles y tamaño de grano de la superficie. La selección de parámetros dependió de cada conjunto experimental de imágenes. Una vez definidos los parámetros, se realizó un análisis por lotes para calcular la cantidad total de superficies superpuestas entre dos canales. El análisis se realizó en imágenes en mosaico de 2 × 2 adquiridas con un aumento de × 20 del microscopio confocal Zeiss 880, donde se tomaron imágenes de 2 a 4 secciones diferentes por portaobjetos de dos a tres animales independientes por condición.

El corazón y parte de la aorta torácica ascendente se extrajeron de ratones sacrificados, se fijaron en formalina tamponada al 10% (Fisher Scientific) durante 72 h y se procesaron con etanol graduado, xileno y parafina en un procesador automatizado Leica Peloris. Se cortaron secciones de cinco micrones incluidas en parafina paralelas al eje largo del corazón de dos a tres niveles distintos (400 μm, 800 μm y 1200 μm; o 800 μm y 1200 μm). Se desparafinaron secciones del corazón de 4 cámaras y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Η&E) en un teñidor histoquímico automatizado Leica ST5020 o se inmunotiñeron en un teñidor automático Leica BondRX®, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones para inmunotinción se sometieron a recuperación de epítopos durante 20 minutos a 100 °C con solución ER2 de Leica Biosystems (pH 9, AR9640) seguido de una incubación de 30 minutos a 22 °C con anti-CD11b (Novus, NB110-89474) diluido 1 :10.000, con anti-CD3 (CST, 78588S; clon E4T1B) o con anti-CASP3 escindido (CST, 9579S, clon D3E9) diluido 1:1000. Los anticuerpos primarios se detectaron utilizando el sistema de detección de refinado de polímeros BOND (Leica, DS9800). Como controles positivos de la IHC, se tiñeron secciones de bazo de ratón con anti-CASP3 (Figura complementaria 2b), anti-CD3 y anti-CD11b. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina escaneadas en un escáner de portaobjetos completo Leica AT2 o Hamamatsu Nanozoomer HT y se importaron a la base de datos de imágenes de NYU Omero para su visualización y anotación. Un patólogo (NN) analizó ciegamente la gravedad de la patología tisular y la determinación de las diferentes categorías descritas en las Tablas S1 y S5. La tinción con tricrómico de Masson se realizó como se describió anteriormente58. En resumen, los portaobjetos desparafinados se fijaron adicionalmente en solución de Bouin durante 1 hora a 60 °C. Luego, los portaobjetos se tiñeron en serie con hematoxilina Weigert (Polysciences, 25088B1 y B2) durante 10 minutos, seguido de fucsina ácida escarlata de Biebrich (Polysciences, 25088C) durante 1 minuto y ácido fosfotúngstico (Polysciences, 25088D) durante 10 minutos con lavados entre cada paso. Luego, los portaobjetos se transfirieron directamente a azul de anilina (Polysciences, 25088E) durante 5 minutos y se diferenciaron en ácido acético al 1% (Polysciences, 25088f) durante 1 minuto antes de la deshidratación y el montaje con permount (Fisher, SP15-100).

Para determinar el número de células CASP3+ escindidas, se analizaron escaneos de portaobjetos completos utilizando el software de análisis de imágenes VisiopharmR versión 2021.09. Las imágenes se importaron a la base de datos de VisiopharmR. Se realizó un esquema manual de las regiones de interés (ROI) para dividir la sección del corazón de cuatro cámaras en ventrículos derecho, izquierdo, tabique y aurículas. Se generó una aplicación VisiopharmR para detectar células teñidas con DAB en el corazón de un ratón. Brevemente, se ejecutaron pasos de preprocesamiento de imágenes para crear funciones que mejoran la señal DAB y la señal nuclear mediante la deconvolución y el filtrado del color. La segmentación se logró utilizando un algoritmo bayesiano lineal entrenable. Se aplicaron pasos de posprocesamiento para definir los núcleos como positivos o negativos. Se incluyeron controles positivos y negativos para cada análisis. Los resultados se proporcionaron como número de núcleos totales, número de núcleos positivos y número de núcleos negativos por ROI analizado.

Los ratones se infectaron por vía intravenosa con 1E5 UFP de CHIKV o control HI, y se recogieron los corazones a 2 y 5 ppp. Los homogeneizados de tejido cardíaco generados como se describe anteriormente se diluyeron 1:5 en 5X PBS: inhibidor de proteasa HALT sin EDTA (Thermo). La cantidad total de proteína se cuantificó utilizando el ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific) y las muestras se diluyeron a 1,5 mg/ml en PBS: inhibidor de proteasa HALT, se hicieron alícuotas de 75 µl y se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron. Para el suero, la sangre se recogió como se describió anteriormente, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugó a 1000 xg durante 15 minutos a 4 °C. Luego se transfirió la fase superior a un tubo limpio y se centrifugó a 10.000 x g durante 10 min. Las muestras se trasladaron a un tubo limpio y luego se hicieron alícuotas de 50 µl y se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron. Se analizaron los homogeneizados de corazón para determinar los niveles de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de ensayo Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex (Bio-Rad, n.º m60009rdpd). Se analizaron los homogeneizados de corazón y el suero para determinar los niveles de IFN-I utilizando IFN-α/IFN-β 2-plex de ratón ProcartaPlex (ThermoFisher, EPX02A-22187-901). Las citocinas y quimiocinas se registraron en una máquina MAGPIX (Luminex) y se cuantificaron mediante comparación con una curva estándar. Se utilizó el software xPONENT (v 4.3.229.9) para la recopilación y análisis de datos. Los valores informados para todos los analitos estuvieron dentro del límite de detección del método y representan los valores de los resultados de las cuantificaciones de Luminex basadas en las curvas de calibración individuales para cada analito.

Los ratones se infectaron por vía intravenosa con 1E5 UFP de control CHIKV o HI, y se extrajo sangre como se describe anteriormente, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugó a 1000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Luego se transfirió la fase superior a un tubo limpio y se centrifugó a 10.000 x g durante 10 min. Las muestras se trasladaron a un tubo limpio y luego se hicieron alícuotas de 50 µl y se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron. Se analizó el suero para determinar la troponina T cardíaca de ratón utilizando una placa de microtitulación prerevestida (amsbio, AMS.E03T0017) y utilizando una curva estándar de troponina T cardíaca recombinante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los datos de Tabula muris (Tabula Muris et al., 2018) se descargaron de https://tabula-muris.ds.czbiohub.org. Los datos se analizaron utilizando el paquete R Seurat (v3.2.1). Brevemente, los datos se normalizaron utilizando la función "Normalizar datos" con parámetros predeterminados. Después de la normalización, aplicamos la función "Buscar características variables" para identificar genes de interés utilizados para la reducción de dimensionalidad posterior mediante la función "RunPCA" y la agrupación a través de las funciones "Buscar vecinos" y "Buscar grupos", con parámetros predeterminados. Se mantuvieron las anotaciones de grupo originales de Tabula Muris. El diagrama de puntos para la expresión normalizada de marcadores celulares potenciales se generó utilizando la función "DotPlot".

Se asignó significación estadística cuando los valores de P fueron <0,05 utilizando Prism versión 9.5.1 (528) (GraphPad) o R-studio (v3.6.0). Las pruebas específicas con valores P exactos se indican en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos se realizaron al menos en duplicados biológicos.

Los conjuntos de datos de secuenciación de ARN masivos generados en este estudio están disponibles en GEO: GSE204689. Los datos de imágenes de microscopía se almacenan en OMERO Plus v5.6 y se puede acceder a ellos a través del Catálogo de datos de NYU: https://datacatalog.med.nyu.edu/dataset/10621. Conjuntos de datos públicos: genoma de ratón (versión mm10, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/), genoma de CHIKV (AM258994, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 106880547). Base de datos pública: Tabula muris (https://tabula-muris.ds.czbiohub.org). Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual se adjuntan como tabla complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código está disponible en GitHub: https://github.com/fizzo13/CHIKV.

Araiza-Garaygordobil, D. et al. El dengue y el corazón. Cardiovascular. J. Afr. 32, 276–283 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Minhas, AM et al. Asociación del virus Zika con miocarditis, insuficiencia cardíaca y arritmias: una revisión de la literatura. Cureus 9, e1399 (2017).

PubMed PubMed Central Google Académico

Scatularo, CE et al. Zika y el corazón: una revisión sistemática. Tendencias Cardiovasc. Medicina. Apocalipsis 32, 52–58 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Alvarez, MF, Bolivar-Mejia, A., Rodriguez-Morales, AJ & Ramirez-Vallejo, E. Afectación cardiovascular y manifestaciones de la infección sistémica por el virus Chikungunya: una revisión sistemática. F1000Res 6, 390 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Traverse, EM, Hopkins, HK, Vaidhyanathan, V. & Barr, KL Miocardiopatía y muerte después de la infección por chikungunya: un resultado cada vez más común. tropo. Medicina. Infectar. Dis. 6, https://doi.org/10.3390/tropicalmed6030108 (2021).

Farías, L. et al. Miocarditis tras una coinfección reciente por los virus chikungunya y dengue: reporte de un caso. Arq. Sujetadores. Cardiol. 113, 783–786 (2019).

PubMed PubMed Central Google Académico

Cotella, JI, Farina, JM & Noval, MG Enfermedades tropicales desatendidas y otras enfermedades infecciosas que afectan el corazón (ed Baranchuk, A. & Saldarriaga, C.) (Elselvier, 2021).

Villamil-Gomez, WE, Ramirez-Vallejo, E., Cardona-Ospina, JA, Silvera, LA & Rodriguez-Morales, AJ Alteraciones electrocardiográficas en pacientes con fiebre chikungunya de Sucre, Colombia: una serie de 42 casos. Medicina de viaje. Infectar. Dis. 14, 510–512 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

de Lima, STS et al. Desenlace fatal de la infección por el virus chikungunya en Brasil. Clínico. Infectar. Dis. 73, e2436–e2443 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Crosby, L. y col. Manifestaciones graves del virus chikungunya en pacientes críticos durante el brote en el Caribe de 2013-2014. En t. J. Infectar. Dis. 48, 78–80 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Samra, JA, Hagood, NL, Summer, A., Medina, MT & Holden, KR Características clínicas y complicaciones neurológicas de niños hospitalizados con virus chikungunya en Honduras. J. Niño. Neurol. 32, 712–716 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Sharp, TM y col. Características clínicas, histopatología e inmunolocalización tisular del antígeno del virus chikungunya en casos fatales. Clínico. Infectar. Dis. 73, e345-e354 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Acosta-Reyes, J. et al. Altos niveles de biomarcadores cardiovasculares en la infección mortal por el virus Chikungunya. Acta Trop. 237, 106705 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lemant, J. et al. Infección aguda grave por el virus chikungunya que requirió cuidados intensivos durante el brote de la Isla de la Reunión en 2005-2006. Crítico. Cuidado médico. 36, 2536–2541 (2008).

Artículo PubMed Google Scholar

Economopoulou, A. et al. Infecciones atípicas por el virus Chikungunya: manifestaciones clínicas, mortalidad y factores de riesgo de enfermedad grave durante el brote de 2005-2006 en Reunión. Epidemiol. Infectar. 137, 534–541 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hsu, CH et al. Factores de riesgo de hospitalización de pacientes con infección por el virus chikungunya en hospitales centinela de Puerto Rico. PLoS Negl. tropo. Dis. 13, e0007084 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pal, P. y col. Los virus chikungunya que escapan a la terapia con anticuerpos monoclonales están clínicamente atenuados, son estables y no purificados en los mosquitos. J. Virol. 88, 8213–8226 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ella, Z. et al. La pérdida de TLR3 agrava la replicación y la patología del CHIKV debido a una respuesta alterada de anticuerpos neutralizantes específicos del virus. EMBO Mol. Medicina. 7, 24–41 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Langsjoen, RM, Zhou, Y., Holcomb, RJ y Routh, AL El virus chikungunya infecta el corazón e induce cambios transcripcionales específicos del corazón en un modelo de infección en ratón inmunodeficiente. Soy. J. Trop. Medicina. Hig. 106, 99-104 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Noval, MG, Rodríguez-Rodríguez, BA, Rangel, MV y Stapleford, KA La atenuación de alfavirus impulsada por la evolución destaca los determinantes clave de las glicoproteínas que regulan la infectividad y diseminación viral. Representante celular 28, 460–471.e465 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clavarino, G. et al. La inducción de GADD34 es necesaria para la producción de interferón beta dependiente de dsRNA y participa en el control de la infección por el virus Chikungunya. Patógeno PLoS. 8, e1002708 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Camelliti, P., Borg, TK & Kohl, P. Caracterización estructural y funcional de fibroblastos cardíacos. Cardiovascular. Res. 65, 40–51 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lane, EB, Hogan, BL, Kurkinen, M. & Garrels, JI Coexpresión de vimentina y citoqueratinas en células endodérmicas parietales de embriones tempranos de ratón. Naturaleza 303, 701–704 (1983).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Tarbit, E., Singh, I., Peart, JN y Rose'Meyer, RB Biomarcadores para la identificación de fibroblastos y miofibroblastos cardíacos. Fallo cardíaco. Apocalipsis 24, 1-15 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ivey, MJ y Tallquist, MD Definición del fibroblasto cardíaco. Circo. J. 80, 2269–2276 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tabula Muris, C. et al. Transcriptómica unicelular de 20 órganos de ratón creada por Tabula Muris. Naturaleza 562, 367–372 (2018).

ADS del artículo Google Scholar

Mitcheson, JS, Hancox, JC y Levi, AJ Miocitos cardíacos adultos cultivados: aplicaciones futuras, métodos de cultivo, propiedades morfológicas y electrofisiológicas. Cardiovascular. Res. 39, 280–300 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tsukamoto, K. y col. Identificación de la apolipoproteína D como gen cardioprotector utilizando un modelo de ratón de enfermedad arterial coronaria aterosclerótica letal. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, 17023–17028 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, YT y cols. La cardioprotección mediante la respuesta de la proteína desplegada mitocondrial requiere ATF5. Soy. J. Physiol. Corazón. Circo. Fisiol. 317, H472-H478 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schilte, C. y col. El IFN tipo I controla el virus chikungunya mediante su acción sobre células no hematopoyéticas. J. Exp. Medicina. 207, 429–442 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schilte, C. y col. Vanguardia: funciones independientes de IRF-3 e IRF-7 en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas durante la respuesta del huésped a la infección por chikungunya. J. Inmunol. 188, 2967–2971 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Poddar, S., Hyde, JL, Gorman, MJ, Farzan, M. & Diamond, MS El gen IFITM3 estimulado por interferón restringe la infección y la patogénesis de los alfavirus artritogénicos y encefalíticos. J. Virol. 90, 8780–8794 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Werneke, SW y cols. ISG15 es fundamental en el control de la infección por el virus Chikungunya independientemente de la conjugación mediada por UbE1L. Patógeno PLoS. 7, e1002322 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diamond, MS y Farzan, M. Las funciones antivirales de amplio espectro de las proteínas IFIT e IFITM. Nat. Rev. Immunol. 13, 46–57 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fox, JM & Diamond, MS Protección inmunomediada y patogénesis del virus Chikungunya. J. Inmunol. 197, 4210–4218 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, W. y col. La inhibición específica de NLRP3 en la enfermedad de chikungunya revela un papel de los inflamasomas en la inflamación inducida por alfavirus. Nat Microbiol 2, 1435-1445 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ekchariyawat, P. et al. Las vías de señalización del inflamasoma ejercen un efecto antiviral contra el virus Chikungunya en los fibroblastos dérmicos humanos. Infectar. Gineta. Evolución. 32, 401–408 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wilson, JA et al. Análisis de RNA-Seq de la infección por el virus chikungunya e identificación de la granzima A como un importante promotor de la inflamación artrítica. Patógeno PLoS. 13, e1006155 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, J. y col. El análisis de flujo cuantitativo revela una producción de NADPH dependiente de folato. Naturaleza 510, 298–302 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planávila, A. et al. El factor de crecimiento de fibroblastos 21 protege el corazón del estrés oxidativo. Cardiovascular. Res. 106, 19-31 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brauninger, H. y col. La infección cardíaca por SARS-CoV-2 se asocia con alteraciones transcriptómicas proinflamatorias dentro del corazón. Cardiovascular. Res. 118, 542–555 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Lasrado, N., Borcherding, N., Arumugam, R., Starr, TK y Reddy, J. Disección del paisaje celular y la red transcriptómica en la miocarditis viral mediante secuenciación de ARN unicelular. iCiencia 25, 103865 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Z., Nguyen, TT y Valaperti, A. Los fibroblastos cardíacos humanos producen citocinas proinflamatorias tras la estimulación de TLR y RLR. Mol. Celúla. Bioquímica. 476, 3241–3252 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kenney, AD y cols. IFITM3 protege el corazón durante la infección por el virus de la influenza. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 116, 18607–18612 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gorbea, C. et al. Papel de las variantes del receptor tipo Toll 3 en la susceptibilidad del huésped a la miocarditis enteroviral y la miocardiopatía dilatada. J. Biol. Química. 285, 23208–23223 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xing, F. y col. Alteración de la señalización antiviral por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS). MÁS UNO 11, e0151173 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, A., Kontodimas, K. & Bosmann, M. La vía de reconocimiento inmunológico MAVS en infecciones virales y sepsis. Antioxidante. Señal redox. 35, 1376-1392 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGuire, PJ Disfunción mitocondrial y envejecimiento del sistema inmunológico. Biología 8, https://doi.org/10.3390/biology8020026 (2019).

Haist, KC, Burrack, KS, Davenport, BJ y Morrison, TE Los monocitos inflamatorios median el control de la infección aguda por alfavirus en ratones. Patógeno PLoS. 13, e1006748 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Swiecki, M. & Colonna, M. Interferones tipo I: diversidad de fuentes, vías de producción y efectos sobre las respuestas inmunitarias. actual. Opinión. Virol. 1, 463–475 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taniguchi, K. & Karin, M. NF-kappaB, inflamación, inmunidad y cáncer: mayoría de edad. Nat. Rev. Immunol. 18, 309–324 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hum, NR y cols. MAVS media una respuesta inmune protectora en el cerebro al virus de la fiebre del Valle del Rift. Patógeno PLoS. 18, e1010231 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haist, KC, Carpentier, KS, Davenport, BJ y Morrison, TE Las células dendríticas plasmocitoides median el control de la infección por el virus del río Ross a través de un mecanismo independiente de MAVS dependiente de interferón tipo I. J. Virol. 95, https://doi.org/10.1128/JVI.01538-20 (2021).

de Souza, WM et al. Dinámica espaciotemporal y recurrencia del virus chikungunya en Brasil: un estudio epidemiológico. Lancet Microbe 4, e319 – e329 (2023).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Torales, M. et al. Notas de campo: Brote de chikungunya — Paraguay, 2022-2023. Morbo de los CDC. Mortal. Representante semanal 72, 636–638 (2023).

Artículo de Google Scholar

Coffey, LL y Vignuzzi, M. La alternancia de huéspedes del virus chikungunya aumenta la aptitud física al tiempo que restringe la diversidad de la población y la adaptabilidad a nuevas presiones selectivas. J. Virol. 85, 1025-1035 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kaczmarek, ME y cols. Distintas poblaciones de mosquitos Aedes albopictus de la ciudad de Nueva York muestran diferencias en la diversidad de la proteína D7 de las glándulas salivales y la replicación del virus chikungunya. Virus 12, https://doi.org/10.3390/v12070698 (2020).

Carson, FL Histotecnología: un texto de autoinstrucción. 2ª ed. 134-135 (Prensa ASCP, 1997).

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio de Stapleford por sus útiles comentarios sobre este manuscrito. Agradecemos al Laboratorio de Investigación de Patología Experimental de NYUMC, Mark Alu y Branka Brukner Dabovic. También agradecemos al Centro de Tecnología del Genoma de la Universidad de Nueva York por su asistencia durante la secuenciación y al Laboratorio de Microscopía Langone de la Universidad de Nueva York por su asistencia durante la obtención de imágenes. Agradecemos a los Dres. Meike Dittmann y Ken Cadwell quienes amablemente proporcionaron equipos y reactivos esenciales. Agradecemos a los Dres. Dominick Papandrea y Ludovic Desvignes por la asistencia de BSL3. Agradecemos a los Dres. Ken Cadwell y Victor Torres por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un paquete inicial de la Facultad de Medicina Grossman (KAS) de la Universidad de Nueva York, NIH/NIAID R01 AI162774-01A1 (KAS) y 1R01AI143861 (KMK), la subvención piloto del Programa del Centro de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Nueva York (KAS y MGN) , Beca postdoctoral de la Asociación Estadounidense del Corazón 19-A0-00-1003686 (MGN), Premio de capacitación en investigación institucional del servicio de salud pública T32 AI 7180-39 (BAR-R.), Programa de capacitación en inmunología e inflamación Premio de capacitación 5-T32 AI100853- 10 (EB y PDY), Premio de becario a académico de la Sociedad Estadounidense de Hematología ASH 204377-01 (FI), NIH 5F32 HL153598 (PDY). El Laboratorio de Investigación de Patología Experimental (RRID:SCR_017928), el Laboratorio de Microscopía Langone de la NYU (RRID: SCR_017934) y el Núcleo de Tecnología del Genoma de la NYU (RRID: SCR_017929) cuentan con el apoyo parcial de la subvención de apoyo P30CA016087 del Centro Oncológico de la NYU y de Laura e Isaac Perlmutter de Langone de la NYU. Centro Oncológico. El sistema de imágenes multiespectrales Akoya® se adquirió a través de una subvención de instrumentación compartida S10 OD021747.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Maria G. Noval, Kenneth A. Stapleford.

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

María G. Noval, Sophie N. Spector, Eric Bartnicki, Stephen T. Yeung, Payal Damani-Yokota, Bruno A. Rodríguez-Rodríguez, Kamal M. Khanna y Kenneth A. Stapleford

Centro del Genoma de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Franco Izzo

División de Hematología y Oncología Médica, Departamento de Medicina y Centro Oncológico Meyer, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Franco Izzo

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Navneet Narula, M. Zahidunnabi Dewan, Valeria Mezzano y Cynthia Loomis

División de Tecnologías de Investigación Avanzada, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Cynthia Loomis

Perlmutter Cancer Center, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Kamal Khanna

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También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

MGN y KAS concibieron el proyecto y diseñaron los experimentos; MGN, SNS, EB, STY, PDY, BARR realizaron experimentos, FI analizó datos de RNA-seq; MGN, EB, FI y KAS analizaron los datos, CL supervisó los experimentos de histología, NN realizó análisis de histopatología; VM desarrolla la aplicación Visiopharm para análisis histológico; MZD realizó criosecciones en portaobjetos; KK y KAS supervisaron el proyecto. MGN y KAS escribieron el borrador original y todos los autores participaron en la revisión y edición del manuscrito.

Correspondencia a María G. Noval o Kenneth A. Stapleford.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Noval, MG, Spector, SN, Bartnicki, E. et al. La señalización MAVS es necesaria para prevenir la infección cardíaca persistente por chikungunya y la inflamación crónica del tejido vascular. Nat Comuna 14, 4668 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40047-w

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Recibido: 07 de abril de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40047-w

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